सीधी बातचीत के साथ 3 डी सह-संस्कृति: मोनोसाइट्स के साथ कैंसर कोशिकाओं को सह-खेती करना उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए

1.3D सह संस्कृतियों के साथ सीधे बातचीत

1. एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए संस्कृति के बाद प्रत्येक सेल वंश की स्वतंत्र छंटाई की अनुमति देने के लिए सेल संस्कृति से पहले विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ बीआरसी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को लेबल करें। कूमारिन और रोडामाइन के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेरिवेटिव का उपयोग करें जो स्वतंत्र रूप से जीवित कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली से गुजरते हैं। लेबलिंग के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल निम्नलिखित है:
   1. ब्याज की बीआरसी कोशिकाओं का एक मोनोलेयर तैयार करें (2 × 10⁶ कोशिकाओं को 25 सेमी² संस्कृति फ्लास्क में) और मानक माध्यम को फ्लोरोसेंट डाई के पर्याप्त पूर्व-गर्म काम समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें (किसी भी पूरक के बिना मानक आधार माध्यम में फ्लोरोसेंट डाई का 1:2,000)। एक आर्द्र 5% सीओ₂ वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट। डाई समाधान को एस्पिरेट करें और पर्याप्त 1x पीबीएस के साथ धीरे-धीरे कुल्ला करें। पीबीएस को एस्पिरेट करें और मानक माध्यम जोड़ें।
   2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए 0.05% ट्राइप्सिन और 0.48 m EDTA के समाधान के 2 मिलील के साथ सेल मोनोलेयर को ट्रिप्सिनाइज करें। पूरक के बिना ट्रिपसिनाइजेशन और संवाददाता माध्यम के 7 एमएल को रोकने के लिए एफबीएस के 200 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को पिपिंग करके फिर से खर्च करें। एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 10 μL का एक aliquot ले लो । सेल काउंटिंग के बाद सह-संस्कृति प्रोटोकॉल जारी रखें।
   3. आरटी में 5 मिनट के लिए 430 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली (मोनोसाइट्स निलंबन में बढ़ने के बाद से यह पहली बार प्रदर्शन करें)। फ्लोरोसेंट डाई के पूर्व-गर्म काम समाधान (पूरक के बिना एक मानक आधार माध्यम में फ्लोरोसेंट डाई के 1:2,000) के 3 मिलील के साथ सुपरनेट्ट और धीरे-धीरे पुनर्विक्रय कोशिकाओं को त्यागें। एक आर्द्र 5% सीओ₂ वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
   4. कोशिकाओं को फिर से गोली दें, डाई वर्किंग सॉल्यूशन को त्यागें, और धीरे-धीरे 1x पीबीएस के 5-7 एमएल के साथ रीसस्लपेंड करें। एक बार फिर गोली, पीबीएस त्यागें, और मानक माध्यम के 5-7 एमएल में कोशिकाओं को फिर से ढिंढ फेंके। एक न्यूबॉर कक्ष में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सेल निलंबन के 10 माइक्रोन का एक एलिकोट लें। सेल काउंटिंग के बाद सह-संस्कृति प्रोटोकॉल जारी रखें।
2. सह-संस्कृति को इस प्रकार सेट करें: 4-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड सिस्टम के प्रत्येक कुएं में एक भी परत बनाने के लिए अच्छी तरह से नीचे पर्याप्त ईसीएमई फैलाएं। प्लेट 20 एक एकल सेल निलंबन के 20 μL जिसमें 5 × 10 5 लेबल बीआरसी कोशिकाएं प्रति अच्छी^तरह से होती हैं।
3. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 15-20 मिनट के बाद, 80 माइक्रोन परख माध्यम (60% ईसीएमई के साथ पूरक) में 2.5 x 10⁵ लेबल मोनोसाइट्स का निलंबन जोड़ें।
4. ECME को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति दें।
5. बीआरसी कोशिकाओं और मोनोसाइट संस्कृति मीडिया के 1:1 मिश्रण का 1 एमएल जोड़ें।
6. अलग-अलग समय बिंदुओं पर परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए₂₄ एच, 48 एच या 5 दिनों के लिए आर्द्रीकृत 5% सीओ 2 पर्यावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सह-संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
7. संस्कृतियों से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ईसीएम प्रोटीन को नीचा। माध्यम को एस्पिरेट और त्यागें, 0.1% ट्राइप्सिन और 0.25% ईडीटीए के साथ 1x पीबीएस के 0.5 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए 10% एफबीएस के साथ 1x पीबीएस के 0.5 एमएल जोड़ें, और एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए सख्ती से पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
8. आरटी में 5 मिनट के लिए 765 x ग्राम पर पैलेट सेल, सुपरनैंट को त्यागें, और 10% एफबीएस के साथ 1x पीबीएस के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। इस स्टेप को एक बार दोहराएं।
9. उचित साधन के साथ फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए सेल निलंबन विषय। सुनिश्चित करें कि अंतिम आबादी कम से कम 95% शुद्ध हैं)।
10. छंटाई के बाद, बाँझ 1x पीबीएस, गोली (आरटी में 5 मिनट के लिए 430 x ग्राम) के साथ कोशिकाओं को धोएं, और बाँझ 1x पीबीएस में पुनर्सुस्ल करें। कोशिकाओं को आरएनए अलगाव या प्रोटीन विश्लेषण के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया जा सकता है।
11. प्रत्येक परख को तीन बार दोहराएं, जिसमें नियंत्रण के रूप में प्रत्येक व्यक्तिगत सेल वंश की 3डी संस्कृतियां शामिल हैं।