3D-cocultuur met directe interactie: kankercellen co-cultiveren met monocyten om hun interactie te bestuderen

1.3D coculturen met directe interactie

1. Label BrC-cellen en monocyten met verschillende fluorescerende kleurstoffen vóór celkweek om onafhankelijke sortering van elke cellijn na cultuur mogelijk te maken voor analyse van mRNA en eiwitexpressie. Gebruik in de handel verkrijgbaar derivaten van cumarine en rhodamine die vrij door het celmembraan van levende cellen gaan. Een algemeen protocol voor etikettering is het volgende:
   1. Bereid een monolaag van BrC-cellen van belang (2 × 10⁶ cellen in een 25 cm² kweekkolf) en vervang het standaardmedium door voldoende voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof (1:2.000 van de fluorescerende kleurstof in standaardbasismedium zonder aanvulling). Incubeer 30 min bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO₂ omgeving. Aspireer de kleurstofoplossing en spoel voorzichtig af met voldoende 1x PBS. Aspireer de PBS en voeg het standaard medium toe.
   2. Trypsiniseer de celmonolaag met 2 ml oplossing van 0,05% trypsine en 0,48 mM EDTA gedurende 5-10 minuten bij 37 °C. Voeg 200 μL FBS toe om trypsinisatie te stoppen en 7 ml van het correspondentmedium zonder supplementen. Resuspend de cellen door pipetten. Neem een aliquot van 10 μL om cellen in een Neubauer-kamer te tellen. Ga verder met het co-cultuurprotocol na het tellen van de cellen.
   3. Pellet de cellen op 430 x g gedurende 5 minuten bij RT (voer dit eerst uit omdat monocyten in suspensie groeien). Gooi supernatant en voorzichtig geresuspendeerde cellen weg met 3 ml van een voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof (1:2.000 van de fluorescerende kleurstof in een standaard basismedium zonder supplementen). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO_2-omgeving.
   4. Pelleteer de cellen opnieuw, gooi de kleurstofbewerkingsoplossing weg en resuspend voorzichtig met 5-7 ml 1x PBS. Pellet nogmaals, gooi de PBS weg en resuspend cellen in 5-7 ml standaard medium. Neem een aliquot van 10 μL celsuspensie om cellen in een Neubauer-kamer te tellen. Ga verder met het co-cultuurprotocol na het tellen van de cellen.
2. Stel de co-cultuur als volgt in: spreid voldoende ECME uit aan de onderkant van de put om een gelijkmatige laag te vormen in elke put van een 4-put kamerschuifsysteem. Plaat 20 μL van een eencellige suspensie met 5 × 10⁵ gelabelde BrC-cellen per put.
3. Voeg na 15-20 minuten incubatie bij 37 °C een suspensie van 2,5 x 10⁵ gelabelde monocyten toe in 80 μL testmedium (aangevuld met 60% ECME).
4. Laat ECME 15-20 minuten stollen bij 37 °C.
5. Voeg 1 ml van een 1:1 mix van de BrC-cellen en monocytcultuurmedia toe.
6. Incubeer coculturen bij 37 °C in een bevochtigde CO_2-omgeving van 5% gedurende 24 uur, 48 uur of 5 dagen om veranderingen op verschillende tijdstippen bij te houden.
7. Degraderen ECM-eiwitten om de cellen uit de culturen te herstellen. Aspireer en gooi het medium weg, voeg 0,5 ml 1x PBS toe met 0,1% trypsine en 0,25% EDTA en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C. Voeg na incubatie 0,5 ml 1x PBS met 10% FBS toe om de trypsine te neutraliseren en resuspendeer de cellen door krachtig te pipetten om een eencellige suspensie te verkrijgen.
8. Pelletcellen op 765 x g gedurende 5 min bij RT, gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 5 ml 1x PBS met 10% FBS. Herhaal deze stap een keer.
9. Onderwerp de celsuspensie aan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met het juiste instrument. Zorg ervoor dat de uiteindelijke populaties voor minstens 95% zuiver zijn).
10. Was na het sorteren de cellen met steriele 1x PBS, pellet (430 x g gedurende 5 min bij RT) en resuspend in steriel 1x PBS. Cellen kunnen worden verwerkt volgens specifieke protocollen voor RNA-isolatie of eiwitanalyse.
11. Herhaal elke test drie keer, inclusief 3D-culturen van elke afzonderlijke cellijn als besturingselementen.