Overview
此视频描述了一个软阿加菌群形成检测,以测试PADI酶抑制剂和BB-Cl-阿米丁对乳腺癌肿瘤原体 的影响体外。这种检测还能够在遗传扰动的背景下对细胞转化潜力进行定量评估。
Protocol
1. 准备 3% 2- 羟基阿加罗斯
- 放入干净干燥的 100 毫升玻璃瓶中,加入 0.9 克 2 羟基蔗糖(Agarose VII),然后加入 30 毫升蒸馏水。
- 微波混合物15秒,轻轻旋转。重复此步骤至少三次,直到阿加罗斯粉完全溶解。
- 将含溶液的瓶子自动封装 15 分钟。
- 允许阿加罗斯解决方案冷却到 RT, 然后再进一步使用。在 RT 中存储解决方案。
2. 底部层的准备: 0.6% 阿加罗斯凝胶
- 在 37 °C 孵化器中预热几个 5 毫升和 10 毫升移液器,以防止处理时在移液器中凝固 agarose。
- 部分松开瓶盖,将预制的 3% 2 羟基 agarose 溶液微波加热 15 秒。然后,轻轻旋转溶液和微波炉15秒。
注意事项: 在旋转阿加罗斯溶液时要小心,因为溶液暴露在空气中时会上升,并可能溢出。 - 如果瓶子里有残留的固体凝胶,微波炉再加热几秒钟。
- 在接下来的步骤中,将含有蔗糖溶液的瓶子保存在 45 °C 的水浴中,以防止蔗糖溶液过早凝固。
- 在 37 °C 的水浴中加热 MCF10DCIS 介质。
注: MCF10DCIS介质由DMEM/F12、5%马血清、5%青霉素链霉素组成。 - 使用预热移液将 3 毫升 3% 的 agarose 溶液转移到无菌 50 毫升圆锥管中。
- 立即添加 12 毫升温暖的 MCF10DCIS 介质,并轻轻地倒置圆锥管,将蔗糖与介质混合。尽量不要形成任何气泡,因为它会干扰以后的殖民地计数。
- 在不形成任何气泡的情况下,将2毫升这种混合物加入6井培养板的每口井中。
- 在 4 °C 的平面上水平孵育 6 井培养板 1 小时,使混合物凝固。
- 混合物凝固后,将盘子放入 37 °C 的孵化器中 30 分钟。底部层现已准备就绪,可以使用。
3. 准备含细胞层: 0.3% 阿加罗斯凝胶
- 尝试对MCF10DCIS细胞进行脱脂,并稀释到4 x 104/ml的细胞浓度。
- 使用预热移液器服用 3% 的 agarose 的 2 毫升,并转移到无菌的 50 毫升圆锥管中。
- 立即将 8 毫升 MCF10DCIS 介质添加到圆锥管中,然后轻轻地倒置,将 agarose 与介质混合。避免形成任何气泡。
- 服用2毫升MCF10DCIS细胞(4 x 104/ml),用BB-CLA(0μM(DMSO)或1μM治疗。
- 在 1:1 稀释中,将细胞与 0.6% 的 agarose 混合。
- 取1毫升的细胞-糖混合物,轻轻地添加到6井培养板的底层(2 x 104细胞/毫升)。
- 将 6 井培养板水平放置在 4 °C 的平面上至少 15 分钟,以便顶部层凝固。
- 混合物凝固后,将盘子放入 37 °C 孵化器中一周,然后再添加喂食层。
4. 准备喂食层: 0.3% 阿加罗斯凝胶
- 微波预制的3%2-羟基糖溶液15秒,轻轻旋转溶液,微波再旋转15秒。
- 在 45 °C 的水浴中平衡 agarose 溶液瓶。
- 在 37 °C 的水浴中加热 MCF10DCIS 介质。
- 将 1 毫升 3% 的蔗糖溶液与 9 毫升温暖的 MCF10DCIS 介质混合到 50 毫升圆锥管中,轻轻倒置,将蔗糖与介质混合。避免形成气泡。
- 用BB-CLA(0μM(DMSO)或1μM治疗混合物。
- 将1毫升这种混合物(不形成气泡)轻轻加入包含底部和软层的6井培养板的每口井中。
- 将 6 井培养板水平放置在 4 °C 的平面上至少 15 分钟,使混合物凝固。
- 支线层凝固后,将板放入 37 °C 孵化器中。
- 每周重复此喂食过程,将 1 毫升 0.3% 的 agarose/中/处理溶液叠加到现有的喂食层上,以新介质补充细胞,直到观察到菌落形成。
注: 软层和喂食层中的 Agar 非常柔软,因此,来自喂料层的添加营养物质很容易扩散到含细胞层中以到达细胞。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |