Yumuşak Agar Koloni Oluşumu Tahlil: Yeni Bileşiklerin Kanser Hücre Çoğalması Üzerindeki Etkilerini Test Etmek İçin Bir Yöntem

1. % 3 Hazırlanması 2-Hidroksetil Agarose

1. Temiz, kuru 100 ml cam şişeye 0,9 g 2 hidroksiyetil agarose (Agarose VII) ve ardından 30 ml damıtılmış su ekleyin.
2. Karışımı 15 saniye mikrodalgaya koyun ve hafifçe döndürün. Agarose tozu tamamen çözünene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
3. Çözelti içeren şişeyi 15 dakika boyunca otoklavlayın.
4. Daha fazla kullanmadan önce agarose çözeltisinin RT'ye soğumasını bekleyin. Çözümü RT'de saklayın.

2. Alt Tabakanın Hazırlanması: 0.6% Agarose Jel

1. Agarose'un elleçleme sırasında pipette katılaşmasını önlemek için 37 °C'lik bir inkübatörde birkaç 5 ml ve 10 ml pipetleri önceden ısıtın.
2. Şişe kapağını kısmen gevşetin ve önceden yapılmış% 3 2 hidroksetil agarose çözeltisini 15 saniye boyunca mikrodalga fırınlayın. Ardından, çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha hafifçe döndürün.
   DİkKAT: Agarose çözeltisini döndürürken dikkatli olun, çünkü çözelti havaya maruz kaldığında yükselir ve üzerine dökülebilir.
3. Şişede artık katı jel varsa, birkaç saniye daha mikrodalga fırınlayın.
4. Agarose çözeltisinin zamanından önce katılaşmasını önlemek için sonraki adımlar sırasında agarose çözeltisini içeren şişeyi 45 °C'lik bir su banyosunda tutun.
5. 37 °C su banyosunda sıcak MCF10DCIS ortamı.
   NOT: MCF10DCIS ortam DMEM/F12, %5 at serumu, %5 penisilin streptomisiden oluşur.
6. Önceden ısıtılmış pipetleri kullanarak% 3 agarose çözeltisinin 3 ml'sini steril 50 ml konik bir tüpe aktarın.
7. Hemen 12 ml sıcak MCF10DCIS ortamı ekleyin ve agarose'u medya ile karıştırmak için konik tüpü hafifçe ters çevirin. Daha sonra koloni sayımına müdahale edeceği için herhangi bir kabarcık oluşturmamaya çalışın.
8. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan 6 kuyulu bir kültür plakasının her kuyusuna 2 ml bu karışımı hafifçe ekleyin.
9. Karışımın katılaşmasını sağlamak için 6 kuyulu kültür plakasını 4 °C'de düz bir yüzeyde yatay olarak 1 saat boyunca kuluçkaya bırakın.
10. Karışım katılaştıktan sonra, plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.

3. Hücre İçeren Tabakanın Hazırlanması: % 0.3 Agarose Jel

1. MCF10DCIS hücrelerini deneyin ve 4 x¹⁰ 4 /ml hücre konsantrasyonuna seyreltin.
2. Önceden ısıtılmış pipetler kullanarak% 3 agarose'un 2 ml'sini alın ve steril 50 ml konik bir tüpe aktarın.
3. Konik tüpe hemen 8 ml MCF10DCIS ortam ekleyin ve agarose'u medya ile karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Herhangi bir kabarcık oluşturmaktan kaçının.
4. 2 ml MCF10DCIS hücresi (4 x 10⁴ /ml) alın ve BB-CLA (0 μM (DMSO) veya 1 μM ile tedavi edin.
5. 1:1 seyreltmede, hücreleri% 0.6 agarose ile karıştırın.
6. Hücre-agarose karışımından 1 ml alın ve 6 kuyu kültür plakasının alt tabakasına (2 x 10⁴ hücre/ml) hafifçe ekleyin.
7. Üst tabakanın katılaşmasını sağlamak için 6 kuyulu kültür plakasını 4 °C'de düz bir yüzeye en az 15 dakika yatay olarak yerleştirin.
8. Karışım katılaştıktan sonra, besleme tabakasını eklemeden önce plakayı bir hafta boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

4. Besleyici Tabakasının Hazırlanması: % 0.3 Agarose Jel

1. Mikrodalga önceden yapılmış% 3 2-Hidroksiyetil agarose çözeltisi 15 saniye boyunca.
2. Agarose çözelti şişesini 45 °C su banyosunda aşındırın.
3. MCF10DCIS medyasını 37 °C su banyosunda ısıtın.
4. 1 ml% 3 agarose çözeltisini 9 ml sıcak MCF10DCIS ortamı ile 50 ml konik bir tüpe karıştırın ve agaroseyu medya ile karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
5. Karışımı BB-CLA (0 μM (DMSO) veya 1 μM ile tedavi edin.
6. Alt ve yumuşak katmanları içeren 6 kuyulu kültür plakasının her kuyusuna bu karışımdan 1 ml (kabarcık oluşturmadan) hafifçe ekleyin.
7. Karışımın katılaşmasını sağlamak için 6 kuyulu kültür plakasını 4 °C'de düz bir yüzeye en az 15 dakika yatay olarak yerleştirin.
8. Besleyici tabakası katılaştıktan sonra plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
9. Koloni oluşumu gözlenene kadar hücreleri yeni ortamla yenilemek için mevcut besleyici tabakasına 1 ml%0,3 agarose/orta/tedavi çözeltisi bindirerek bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın.
   NOT: Yumuşak ve besleyici katmanlardaki ağar çok yumuşaktır ve bu nedenle besleyici tabakasından eklenen besinler hücrelere ulaşmak için hücre içeren katmana kolayca yayılır.