软阿加结肠形成分析：一种测试新颖化合物对癌细胞增殖影响的方法

首先，在圆锥管中适当集中熔融的糖，并添加所需的温暖培养介质。轻轻倒置以混合内容。将这种混合物加入六井板的每口井中，使其凝固。这是底层。接下来，用感兴趣的化合物治疗癌细胞，并添加所需的糖分浓度。

现在，将这种混合物中含有每毫升所需细胞数的混合物倒入每口井中。这是一个包含细胞的层。一旦介质凝固，在37摄氏度下孵化板一周。通过将蔗糖混合到介质中，并补充这种混合物与兴趣复合物来准备喂食层。轻轻地将此馈线层添加到每个井中，使其凝固，并在 37 摄氏度下孵化板。

每周重复此喂养过程，用介质补充细胞，直到菌落形成。如果利益的化合物是肿瘤原性的抑制剂，它会抑制细胞生长，导致井中的菌落很少。在下列协议中，我们将执行软 阿加 结肠形成检测，以研究PADI抑制剂对乳腺癌细胞肿瘤原性的影响。

开始这个程序，准备3%2-羟基糖。放入干净干燥的 100 毫升玻璃瓶中，加入 0.9 克 2 羟基 agarose，然后加入 30 毫升蒸馏水。微波混合物15秒，轻轻旋转。重复此步骤，直到阿加罗斯粉完全溶解。接下来，将装有瓶子的溶液高压灭菌15分钟。

在进一步使用之前，让蔗糖溶液冷却到室温。在37摄氏度的孵化器中预热几个5毫升和10毫升的移液器，以防止在处理时在移液器中凝固。部分松开瓶盖，将预制的 3% 2 羟基 agarose 溶液微波加热 15 秒。然后轻轻旋转溶液和微波炉15秒。

在旋转阿加罗斯溶液时要小心，因为溶液暴露在空气中时会上升，并可能溢出。如果瓶子里有残留的固体凝胶，微波炉再加热几秒钟。在接下来的步骤中，将含有蔗糖溶液的瓶子保存在 45 摄氏度的水浴中，以防止糖溶液过早凝固。

接下来，使用预热移液器将 12 毫升加热介质转移到无菌的 50 毫升圆锥管中。立即加入三毫升的3%的糖溶液，轻轻倒置圆锥管，将糖与介质混合。然后在六井培养板的每口井中轻轻加入两毫升这种混合物，而不会形成任何气泡。在四摄氏度的平面上水平孵育六井培养板一小时，使混合物凝固。

混合物凝固后，将盘子放入37摄氏度的孵化器中30分钟。底部层现已准备就绪，可以使用。

这个过程的一个困难的方面是确保所有细胞均匀分布，并且融化的蔗糖凝胶在加入每口井之前不会凝固，以确保细胞在加入液体糖胶之前在介质中混合。此外，移液器事先预热，以避免解决方案在处理时凝固。

要准备包含层的细胞，首先尝试对 MCF10DCIS 细胞进行脱脂，并将其稀释到每毫升 40，000 个细胞的细胞浓度。然后使用预热移液器取出八毫升介质，然后转移到无菌的 50 毫升圆锥管中。立即在圆锥管中加入两毫升3%的糖，并轻轻地倒置，将糖与介质混合。避免形成任何气泡。

接下来，取两毫升的细胞，用DMSO中的两微摩尔BB-氯胺酮（或仅DMSO作为控制）来治疗它们。治疗后，将细胞与0.6%的阿加罗斯混合在一对一稀释中，使最终浓度为一微摩尔BB-氯-阿米丁。然后取一毫升的细胞-糖混合物，轻轻地加入六井培养板的底层。

将六井培养板水平放置在4摄氏度的平面上至少15分钟，使顶层凝固。混合物凝固后，将盘子放入37摄氏度的孵化器中一周，然后加入喂食层。开始喂养层准备，微挥动预先制作的3%2-羟基糖溶液，并在45摄氏度的水浴中平衡糖溶液瓶。

将一毫升3%的蔗糖溶液与9毫升的暖介质混合到50毫升的圆锥管中，轻轻倒置，将蔗糖与介质混合。避免形成气泡。在用BB-氯-阿米丁处理混合物后，将混合物的一毫升轻轻加入含有底部和软层的六井培养板的每口井中。然后将六井培养板水平放置在4摄氏度的平面上至少15分钟，使混合物凝固。

喂料层凝固后，将板放入37摄氏度的孵化器中。每周重复此喂食过程，将 0.3% agarose 中等处理溶液的一毫升叠加到现有喂食层上，以新介质补充细胞，直到观察到菌落形成。