Overview
Este vídeo descreve um ensaio de formação de colônia de ágar macio para testar os efeitos de um inibidor de enzima PADI e bb-cl-amidine sobre tumorigenicidade de câncer de mama in vitro. Este ensaio também permite a avaliação quantitativa do potencial de transformação celular no contexto das perturbações genéticas.
Protocol
1. Preparação de 3% 2-Hidroxietila Agarose
- Em uma garrafa de vidro limpa e seca de 100 ml, adicione 0,9 g de 2-hidroxietila agarose (Agarose VII) seguido por 30 ml de água destilada.
- Micro-ondas a mistura por 15 segundos e redemoinho suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó de agarose se dissolva completamente.
- Autoclave a garrafa contendo solução por 15 minutos.
- Permita que a solução agarose esfrie para RT antes de usar mais. Armazene a solução na RT.
2. Preparação da Camada Inferior: 0,6% Gel Agarose
- Pré-aqueça várias pipetas de 5 ml e 10 ml em uma incubadora de 37 °C para evitar que a agarose se solidifique na pipeta durante o manuseio.
- Solte parcialmente a tampa da garrafa e micro-ondas a solução de 3% de hidroxietila agarose por 15 segundos. Em seguida, gire suavemente a solução e micro-ondas por mais 15 segundos.
ATENÇÃO: Tenha cuidado ao rodar a solução agarose porque a solução surge quando exposta ao ar e pode transbordar. - Se houver gel sólido residual na garrafa, micro-ondas por mais alguns segundos.
- Mantenha a garrafa contendo a solução agarose em um banho de água de 45 °C durante os próximos passos para evitar que a solução agarose se solidifique prematuramente.
- Mídia quente MCF10DCIS em um banho de água de 37 °C.
NOTA: A mídia MCF10DCIS consiste em DMEM/F12, 5% soro de cavalo, 5% estreptomicina de penicilina. - Transfira 3 ml da solução de 3% de agarose usando as pipetas pré-aquecidas em um tubo cônico estéril de 50 ml.
- Adicione imediatamente 12 ml de mídia MCF10DCIS quente e inverta suavemente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formar bolhas, pois vai interferir com a contagem da colônia mais tarde.
- Adicione suavemente 2 ml desta mistura em cada poço de uma placa de cultura de 6 poços sem formar bolhas de ar.
- Incubar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente em uma superfície plana a 4 °C por 1 hora para permitir que a mistura se solidifique.
- Depois que a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min. A camada inferior está agora pronta para uso.
3. Preparação da camada contendo células: 0,3% Gel Agarose
- Experimentpsinize as células MCF10DCIS e dilua-as a uma concentração celular de 4 x 104 /ml.
- Tome 2 ml da 3% de agarose usando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 ml.
- Adicione imediatamente 8 ml de mídia MCF10DCIS ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar a agarose com a mídia. Evite formar bolhas.
- Pegue 2 ml das células MCF10DCIS (4 x 104 /ml) e trate com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
- Em uma diluição de 1:1, misture as células com a ágarose de 0,6%.
- Pegue 1 ml da mistura de agarose celular e adicione suavemente a camada inferior da placa de cultura de 6 poços (2 x 104 células/ml).
- Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana a 4 °C por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior se solidifique.
- Depois que a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C durante uma semana antes de adicionar a camada de alimentação.
4. Preparação da camada alimentador: 0,3% Gel Agarose
- Micro-ondas a solução pré-fabricada 3% 2-Hidroxiethyl agarose por 15 segundos. suavemente redemoinho a solução e micro-ondas por mais 15 segundos.
- Equilibre a garrafa de solução de agarose em um banho de água de 45 °C.
- Aqueça a mídia MCF10DCIS em um banho de água de 37 °C.
- Misture 1 ml de solução de 3% de agarose com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo cônico de 50 ml e inverta suavemente para misturar a ágarose com a mídia. Evite formar bolhas de ar.
- Trate a mistura com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
- Adicione suavemente 1 ml desta mistura (sem formar bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo as camadas inferior e macia.
- Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana a 4 °C por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura se solidifique.
- Depois que a camada de alimentador se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C.
- Repita este procedimento alimentar semanalmente sobrepondo 1 ml de 0,3% de solução de agarose/meio/tratamento na camada alimentador existente para repor as células com novas mídias até que a formação da colônia seja observada.
NOTA: Ágar nas camadas macias e alimentador é muito macio e, portanto, os nutrientes adicionados da camada alimentador facilmente difundirão na camada contendo células para alcançar as células.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |