Soft Agar Colony Formation Assay: En metode til at teste virkningerne af nye forbindelser på kræftcellespredning

1. Præparat af 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. I en ren, tør 100 ml glasflaske tilsættes 0,9 g 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII) efterfulgt af 30 ml destilleret vand.
2. Mikrobølgeovn blandingen i 15 sek og forsigtigt hvirvel. Gentag dette trin mindst tre gange mere, indtil agarosepulveret er helt opløst.
3. Autoklaver den opløsningsholdige flaske i 15 minutter.
4. Lad agaroseopløsningen køle af til RT før videre brug. Gem løsningen på RT.

2. Forberedelse af det nederste lag: 0,6% Agarose Gel

1. Forvarmes flere 5 ml og 10 ml pipetter i en 37 °C inkubator for at forhindre agarose i at størkne i pipetten ved håndtering.
2. Flaskelåget løsnes delvist, og den forfreføjede 2-hydroxyethyl agaroseopløsning er færdigfrelstillet i 15 sek. Derefter hvirvles opløsningen og mikrobølgeovnen forsigtigt i yderligere 15 sek.
   ADVARSEL: Vær forsigtig, når du hvirvler agaroseopløsningen, fordi opløsningen stiger op, når den udsættes for luft og kan smitte af.
3. Hvis der er resterende fast gel i flasken, mikrobølgeovn i et par sekunder mere.
4. Flasken med agaroseopløsningen opbevares i et vandbad på 45 °C under de næste trin for at forhindre, at agaroseopløsningen størkner for tidligt.
5. Varme MCF10DCIS medier i et 37 °C vandbad.
   BEMÆRK: MCF10DCIS medier består af DMEM/F12, 5% hesteserum, 5% penicillin streptomycin.
6. 3 ml af 3% agaroseopløsningen overføres ved hjælp af de forvarmede pipetter til et sterilt 50 ml konisk rør.
7. Tilsæt straks 12 ml varmt MCF10DCIS-medie, og vend forsigtigt det koniske rør for at blande agarose med mediet. Prøv ikke at danne nogen bobler, da det vil forstyrre kolonitællingen senere.
8. Tilsæt forsigtigt 2 ml af denne blanding i hver brønd af en 6-brønds kulturplade uden at danne luftbobler.
9. 6-brøndskulturpladen inkuberes vandret på en flad overflade ved 4 °C i 1 time, så blandingen kan størkne.
10. Efter at blandingen er størkner, anbringes pladen i en 37 °C inkubator i 30 min. Det nederste lag er nu klar til brug.

3. Forberedelse af det celleholdige lag: 0,3% Agarose Gel

1. Trypsiniser MCF10DCIS-celler og fortynd dem til en cellekoncentration på 4 x 10⁴ /ml.
2. Der tages 2 ml af de 3% agarose ved hjælp af forvarmede pipetter, og der overføres til et sterilt 50 ml konisk rør.
3. Tilsæt straks 8 ml MCF10DCIS-medier til konisk rør og vend forsigtigt for at blande agarose med mediet. Undgå at danne bobler.
4. Der tages 2 ml AF MCF10DCIS-cellerne (4 x 10^4/ml) og behandles med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
5. I en 1:1 fortynding blandes cellerne med 0,6% agarose.
6. Tag 1 ml af celle-agarose blandingen og tilsæt forsigtigt på det nederste lag af 6-brønds kulturpladen (2 x 10⁴ celler/ ml).
7. 6-brøndskulturpladen anbringes vandret på en flad overflade ved 4 °C i mindst 15 minutter, så det øverste lag kan størkne.
8. Efter at blandingen er størkner, anbringes pladen i en 37 °C inkubator i en uge, før der tilsættes fodringslaget.

4. Tilberedning af fødelaget: 0,3% Agarose Gel

1. Mikrobølgeovn pre-made 3% 2-Hydroxyethyl agarose løsning i 15 sek. forsigtigt hvirvle opløsningen og mikrobølgeovn i yderligere 15 sek.
2. Agaroseopløsningsflasken skal ligestilles i et vandbad på 45 °C.
3. Varm MCF10DCIS-mediet i et 37 °C vandbad.
4. Der blandes 1 ml 3% agaroseopløsning med 9 ml varmt MCF10DCIS-medie i et 50 ml konisk rør og inverteres forsigtigt for at blande agarose med mediet. Undgå at danne luftbobler.
5. Blandingen behandles med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
6. Tilsæt forsigtigt 1 ml af denne blanding (uden at danne bobler) i hver brønd af den 6-brønds kulturplade, der indeholder bunden og bløde lag.
7. 6-brøndskulturpladen anbringes vandret på en flad overflade ved 4 °C i mindst 15 minutter, så blandingen kan størkne.
8. Når fødelaget er størkner, anbringes pladen i en 37 °C inkubator.
9. Denne fodringsprocedure gentages ugentligt ved at overlejre 1 ml 0,3% agarose/medium/behandlingsopløsning på det eksisterende fødelag for at fylde cellerne med nye medier, indtil kolonidannelsen er observeret.
   BEMÆRK: Agar i de bløde og feeder lag er meget blød, og derfor vil de tilsatte næringsstoffer fra fødelaget let spredes ind i det celleholdige lag for at nå cellerne.