Soft Agar Colony Formation Assay: En metode for å teste effekter av nye forbindelser på kreftcelleproliferasjon

1. Tilberedning av 3% 2-Hydroksyetyl Agarose

1. I en ren, tørr 100 ml glassflaske, tilsett 0,9 g 2-hydroksyetyl agarose (Agarose VII) etterfulgt av 30 ml destillert vann.
2. Mikrobølgeovn blandingen i 15 sek og virvle forsiktig. Gjenta dette trinnet minst tre ganger til agarosepulveret helt oppløses.
3. Autoklaver den løsningsholdige flasken i 15 min.
4. La agaroseløsningen avkjøles til RT før videre bruk. Oppbevar løsningen hos RT.

2. Forberedelse av bunnlaget: 0,6% Agarose Gel

1. Forvarm flere 5 ml og 10 ml pipetter i en 37 °C inkubator for å forhindre at agaroseen størkner i pipetten ved håndtering.
2. Løsne flaskelokket delvis og mikrobølgeovn den ferdiglagde 3% 2-hydroksyetyl agarose oppløsningen i 15 sek. Virvle deretter forsiktig løsningen og mikrobølgeovnen i ytterligere 15 sek.
   FORSIKTIG: Vær forsiktig når du virvler agaroseløsningen fordi løsningen stiger opp når den utsettes for luft og kan smitte over.
3. Hvis det er gjenværende solid gel i flasken, mikrobølgeovn i noen sekunder til.
4. Oppbevar flasken som inneholder agaroseoppløsningen i et 45 °C vannbad i de neste trinnene for å forhindre at agaroseløsningen størkner for tidlig.
5. Varm MCF10DCIS media i et 37 °C vannbad.
   MERK: MCF10DCIS media består av DMEM / F12, 5% hesteserum, 5% penicillin streptomycin.
6. Overfør 3 ml av den 3% agarose oppløsningen ved hjelp av de forvarmede pipettene til et sterilt 50 ml konisk rør.
7. Tilsett umiddelbart 12 ml varme MCF10DCIS-medier og inverter forsiktig det koniske røret for å blande agarose med media. Prøv å ikke danne noen bobler, da det vil forstyrre kolonitellingen senere.
8. Tilsett forsiktig 2 ml av denne blandingen i hver brønn av en 6-brønns kulturplate uten å danne noen luftbobler.
9. Inkuber 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i 1 time slik at blandingen kan størkne.
10. Etter at blandingen størkner, plasser platen i en 37 °C inkubator i 30 minutter. Det nederste laget er nå klart til bruk.

3. Tilberedning av det celleholdige laget: 0,3% Agarose Gel

1. Prøv MCF10DCIS-celler og fortynn dem til en cellekonsentrasjon på 4 x 10⁴ /ml.
2. Ta 2 ml av 3% agarose ved hjelp av forvarmede pipetter og overfør til et sterilt 50 ml konisk rør.
3. Tilsett umiddelbart 8 ml MCF10DCIS-medier i det koniske røret og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne noen bobler.
4. Ta 2 ml av MCF10DCIS-cellene (4 x 10⁴ /ml) og behandle med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
5. I en 1:1 fortynning blander du cellene med 0,6% agarose.
6. Ta 1 ml av celle-agaroseblandingen og legg forsiktig til bunnlaget på 6-brønns kulturplaten (2 x 10⁴ celler / ml).
7. Plasser 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i minst 15 minutter, slik at topplaget kan størkne.
8. Etter at blandingen størkner, legg platen i en 37 ° C inkubator i en uke før du legger til fôringslaget.

4. Tilberedning av materlaget: 0,3% Agarose Gel

1. Mikrobølgeovn den ferdiglagde 3% 2-Hydroxyethyl agarose oppløsningen i 15 sek. virvle forsiktig løsningen og mikrobølgeovnen i ytterligere 15 sek.
2. Likevekt agaroseoppløsningsflasken i et 45 °C vannbad.
3. Varm opp MCF10DCIS-mediet i et vannbad på 37 °C.
4. Bland 1 ml 3% agaroseoppløsning med 9 ml varme MCF10DCIS-medier i et 50 ml konisk rør og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne luftbobler.
5. Behandle blandingen med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
6. Tilsett forsiktig 1 ml av denne blandingen (uten å danne bobler) i hver brønn av den 6-brønns kulturplaten som inneholder de nederste og myke lagene.
7. Plasser 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i minst 15 minutter for å la blandingen størkne.
8. Etter at materlaget størkner, plasser platen i en 37 °C inkubator.
9. Gjenta denne fôringsprosedyren ukentlig ved å legge over 1 ml 0,3% agarose / medium / behandlingsløsning på det eksisterende materlaget for å fylle cellene med nye medier til kolonidannelse er observert.
   MERK: Agar i de myke og materlagene er veldig myk, og derfor vil de tilsatte næringsstoffene fra materlaget lett spre seg inn i det celleholdige laget for å nå cellene.