Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de los nuevos compuestos sobre la proliferación de células cancerosas

1. Preparación del 3% 2-Hidroxietil Agarose

1. En una botella de vidrio limpia y seca de 100 ml, agregue 0,9 g de agarose de 2 hidroxietil (Agarose VII), seguida de 30 ml de agua destilada.
2. Microondas la mezcla durante 15 s y remolino suavemente. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarose se disuelva por completo.
3. Autoclave el frasco que contiene la solución durante 15 min.
4. Permita que la solución de agarose se enfríe a RT antes de su uso posterior. Almacene la solución en RT.

2. Preparación de la capa inferior: 0.6% Gel de Agarose

1. Precalentar varias pipetas de 5 ml y 10 ml en una incubadora de 37 °C para evitar que la agarose se solidifique en la pipeta al manipularla.
2. Afloje parcialmente la tapa de la botella y el microondas la solución prefaseada de 3% 2 hidroxietil agarose durante 15 s. Luego, arremolina suavemente la solución y el microondas durante otros 15 s.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al girar la solución de agarose porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede derramarse.
3. Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más.
4. Mantenga la botella que contiene la solución de agarose en un baño de agua de 45 °C durante los siguientes pasos para evitar que la solución de agarose se solidifique prematuramente.
5. Medios MCF10DCIS calientes en un baño de agua de 37 °C.
   NOTA: Los medios MCF10DCIS consisten en DMEM/F12, 5% suero de caballo, 5% estreptomicina de penicilina.
6. Transfiera 3 ml de la solución de agarose al 3% utilizando las pipetas precalentadas en un tubo cónico estéril de 50 ml.
7. Agregue inmediatamente 12 ml de medios MCF10DCIS calientes e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarose con los medios. Trate de no formar ninguna burbuja, ya que interferirá con el conteo de colonias más tarde.
8. Agregue suavemente 2 ml de esta mezcla en cada pozo de una placa de cultivo de 6 pozos sin formar burbujas de aire.
9. Incubar la placa de cultivo de 6 pozos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique.
10. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora de 37 °C durante 30 min. La capa inferior ya está lista para su uso.

3. Preparación de la capa que contiene células: 0.3% gel de agarose

1. Pruebe las células MCF10DCIS y diluyalas a una concentración celular de 4 x 10⁴ /ml.
2. Tome 2 ml del 3% de agarose usando pipetas pre-calentadas y transfiéralo a un tubo cónico estéril de 50 ml.
3. Agregue inmediatamente 8 ml de soporte MCF10DCIS al tubo cónico e invierta suavemente para mezclar la agarose con los medios. Evite formar burbujas.
4. Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10⁴ /ml) y trate con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
5. En una dilución de 1:1, mezcle las células con el 0,6% de agarose.
6. Tome 1 ml de la mezcla de agarose celular y agregue suavemente sobre la capa inferior de la placa de cultivo de 6 pozos (2 x 10⁴ células/ml).
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pozos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique.
8. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora de 37 °C durante una semana antes de agregar la capa de alimentación.

4. Preparación de la capa alimentadora: 0.3% Gel de Agarose

1. Microondas la solución de agarose prefaseada de 3% 2-Hidroxietil durante 15 s. arremolina suavemente la solución y el microondas durante otros 15 s.
2. Eequilibrar la botella de solución de agarose en un baño de agua de 45 °C.
3. Caliente los medios MCF10DCIS en un baño de agua de 37 °C.
4. Mezcle 1 ml de solución de agarose al 3% con 9 ml de medios MCF10DCIS calientes en un tubo cónico de 50 ml e invierta suavemente para mezclar la agarose con los medios. Evite formar burbujas de aire.
5. Tratar la mezcla con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
6. Agregue suavemente 1 ml de esta mezcla (sin formar burbujas) en cada pozo de la placa de cultivo de 6 pozos que contiene las capas inferiores y suaves.
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pozos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique.
8. Después de que la capa alimentadora se solidifique, coloque la placa en una incubadora de 37 °C.
9. Repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo 1 ml de solución de agarose/medium/treatment del 0,3% sobre la capa alimentadora existente para reponer las células con nuevos medios hasta que se observe la formación de colonias.
   NOTA: El agar en las capas blanda y alimentador es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes añadidos de la capa alimentador se difundirán fácilmente en la capa que contiene células para llegar a las células.