Özet

Компетентная модель гепатоцитов, исследующая проникновение вируса гепатита В через таурохолат натрия, котранспортирующий полипептид в качестве терапевтической мишени

Published: May 10, 2022
doi:

Özet

Мы представляем протокол скрининга соединений вируса гепатита В (HBV), нацеленных на стадии жизненного цикла до и после вирусного входа, с использованием изотермической титрующей калориметрии для измерения сродства связывания (KD) с котранспортирующим полипептидом таурохолата натрия хозяина. Противовирусную эффективность определяли путем подавления маркеров жизненного цикла вируса (образование cccDNA, транскрипция и вирусная сборка).

Abstract

Инфекция вируса гепатита В (HBV) считается решающим фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы. Текущее лечение может только уменьшить вирусную нагрузку, но не привести к полной ремиссии. Эффективная модель гепатоцитов для инфекции HBV обеспечит реальный жизненный цикл вируса, который будет иметь решающее значение для скрининга терапевтических агентов. Большинство доступных анти-HBV агентов нацелены на этапы жизненного цикла после поступления вируса, но не до проникновения вируса. Этот протокол детализирует создание компетентной модели гепатоцитов, способной проводить скрининг на терапевтические агенты, нацеленные на стадии жизненного цикла довирусного входа и после вирусного входа. Это включает в себя нацеливание на связывание таурохолата таурохолата натрия (NTCP), образование, транскрипцию и вирусную сборку на основе imHC или HepaRG в качестве клеток-хозяев. Здесь анализ ингибирования входа HBV использовал куркумин для ингибирования функций связывания и транспортировки HBV через NTCP. Ингибиторы оценивали на сродство связывания (KD) с NTCP с использованием изотермической титрационной калориметрии (ITC) – универсального инструмента для скрининга лекарств HBV на основе термодинамических параметров.

Introduction

Инфекция, вызванная вирусом гепатита В (HBV), считается опасным для жизни заболеванием во всем мире. Хроническая инфекция HBV сопряжена с риском цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы1. Современное лечение анти-HBV фокусируется в основном на поствирусном введении с использованием аналогов нуклеоса (t)ide (NA) и интерферона-альфа (IFN-α)2,3. Открытие ингибитора входа HBV, Myrcludex B, определило новую мишень для анти-HBV агентов4. Комбинация ингибиторов входа и АНА при хроническом HBV значительно снизила вирусную нагрузку по сравнению с теми, которые нацелены только на репликацию вируса 5,6. Однако классическая модель гепатоцитов для скрининга ингибиторов входа HBV ограничена низкими уровнями вирусных рецепторов (котранспортирующий полипептид таурохолата натрия, NTCP). Сверхэкспрессия hNTCP в клетках гепатомы (т.е. HepG2 и Huh7) улучшает инфекционность HBV 7,8. Тем не менее, эти клеточные линии экспрессируют низкие уровни ферментов, метаболизирующих лекарства фазы I и II, и проявляют генетическую нестабильность9. Модели гепатоцитов, которые могут помочь нацелиться на различные механизмы соединений-кандидатов против HBV, такие как превирусное вступление, связывание NTCP и проникновение вируса, ускорят идентификацию и разработку эффективных комбинированных схем. Исследование анти-HBV активности куркумина прояснило ингибирование проникновения вируса в качестве нового механизма в дополнение к прерыванию поствирусного входа. Этот протокол детализирует модель хозяина для скрининга входных молекул10 против HBV.

Целью этого метода является изучение потенциальных анти-HBV соединений для ингибирования проникновения вируса, особенно блокирования связывания и транспорта NTCP. Поскольку экспрессия NTCP является критическим фактором для входа в HBV и инфекции, мы оптимизировали протокол созревания гепатоцитов, чтобы максимизировать уровни NTCP11. Кроме того, этот протокол может дифференцировать ингибирующее действие на вход HBV как ингибирование прикрепления HBV по сравнению с ингибированием интернализации. Анализ поглощения таурохолевой кислоты (ТЦА) также модифицировали с использованием метода на основе ИФА вместо радиоизотопа для представления переноса NTCP12,13. Взаимодействие рецептора и лиганда было подтверждено их 3D структурами14,15. Ингибирование функции NTCP может быть оценено путем измерения активности поглощения TCA16. Однако этот метод не предоставил прямых доказательств связывания NTCP с ингибиторами-кандидатами. Таким образом, связывание может быть исследовано с использованием различных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс17, ИФА, анализ теплового сдвига на основе флуоресценции (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen и различные другие методы20. Среди этих методов ITC является целевым стандартом в анализе связывания, поскольку он может наблюдать поглощение тепла или излучение почти в каждой реакции21. Сродство связывания (KD) NTCP и соединений-кандидатов оценивали непосредственно с использованием ITC; эти значения сродства были более точными, чем те, которые были получены с использованием модели прогнозирования in silico 22.

Этот протокол охватывает методы созревания гепатоцитов, инфекции HBV и скрининга на ингибитор входа HBV. Вкратце, модель гепатоцитов была разработана на основе клеточных линий imHC и HepaRG. Культивируемые клетки дифференцировали в зрелые гепатоциты в течение 2 недель. Повышение уровня NTCP было обнаружено с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии11. Вирион гепатита В (HBVcc) был получен и собран из HepG2.2.15. Дифференцированный imHC или HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) профилактически лечили анти-HBV кандидатами за 2 ч до инокуляции вирионом HBV. Ожидаемым результатом эксперимента стала идентификация агентов, снижающих клеточный HBV и инфекционность. Анти-NTCP активность оценивали с использованием анализа поглощения TCA. Активность NTCP может быть подавлена агентами, которые специально связывали NTCP. Метод ITC был использован для исследования возможности интерактивного связывания, которое могло бы предсказывать ингибиторы и их белки-мишени, определяя сродство связывания (KD) лиганда для рецептора посредством нековалентных взаимодействий биомолекулярного комплекса23,24. Например, KD ≥ 1 × 103 мМ представляет собой слабое связывание, KD ≥ 1 × 106 мкМ представляет собой умеренное связывание, а KD ≤ 1 × 109 нМ представляет собой сильное связывание. ΔG напрямую коррелирует с связывающими взаимодействиями. В частности, реакция с отрицательным ΔG является экзергонической реакцией, указывающей на то, что связывание является спонтанным процессом. Реакция с отрицательным ΔH указывает на то, что процессы связывания зависят от водородной связи и сил Ван-дер-Ваальса. Как поглощение TCA, так и данные ITC могут быть использованы для скрининга агентов против HBV. Результаты этих протоколов могут обеспечить основу не только для скрининга против HBV, но и для взаимодействия с NTCP, оцениваемого через сродство связывания и транспортную функцию. В этой статье описывается подготовка и характеристика клеток-хозяев, экспериментальное проектирование и оценка входа анти-HBV вместе с сродством связывания NTCP.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны выполняться в вытяжке биологической опасности класса II или вытяжке с ламинарным потоком. Обращение с HBV было этически одобрено IRB (MURA2020/1545). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех растворах, реагентах, обо…

Representative Results

Наблюдались особенности созревания печени, включая бинуклеированные клетки и полигонально-образную морфологию (рисунок 1), особенно в дифференцированной стадии имГК (рисунок 1А). Значительное увеличение экспрессии NTCP было измерено в d-HepaRG и d-imHC в 7 и 40 раз…

Discussion

HbV-инфекция инициируется через низкоаффинное связывание с протеогликанами гепарана сульфата (HSPG) на гепатоцитах25 с последующим связыванием с NTCP с последующей интернализацией через эндоцитоз26. Поскольку NTCP является критически важным рецептором для входа HBV, н…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот исследовательский проект поддерживается Университетом Махидол и Таиландским научным исследованием и инновациями (TSRI), отдельно присуждаемым А. Вонгкаджорнсилпу и К. Са-нгиамсунторну. Эта работа была финансово поддержана Управлением Национального совета по научным исследованиям и инновационной политике в области высшего образования через Отдел управления программами по конкурентоспособности (номер гранта C10F630093). A. Wongkajornsilp является получателем гранта Chalermprakiat медицинского факультета больницы Сирирадж Университета Махидол. Авторы хотели бы поблагодарить мисс Савини Симахан (Отличный центр по открытию лекарств, факультет естественных наук, Университет Махидол) за ее помощь с техникой ITC.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

Referanslar

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

View Video