Özet

Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

Published: May 10, 2022
doi:

Özet

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (KD) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

Abstract

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) tem sido considerada um fator de risco crucial para o carcinoma hepatocelular. O tratamento atual só pode diminuir a carga viral, mas não resultar em remissão completa. Um modelo eficiente de hepatócitos para a infecção pelo HBV ofereceria um ciclo de vida viral realista que seria crucial para a triagem de agentes terapêuticos. A maioria dos agentes anti-HBV disponíveis tem como alvo os estágios do ciclo de vida após a entrada viral, mas não antes da entrada viral. Este protocolo detalha a geração de um modelo de hepatócitos competente, capaz de rastrear agentes terapêuticos visando os estágios do ciclo de vida pré-entrada viral e pós-entrada viral. Isso inclui o direcionamento da ligação do polipeptídeo de cotransporte de taurocolato de sódio (NTCP), formação de cccDNA, transcrição e montagem viral com base em imHC ou HepaRG como células hospedeiras. Aqui, o ensaio de inibição de entrada do HBV usou curcumina para inibir as funções de ligação e transporte do HBV via NTCP. Os inibidores foram avaliados quanto à afinidade de ligação (KD) com o NTCP usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC) – uma ferramenta universal para triagem de drogas do HBV com base em parâmetros termodinâmicos.

Introduction

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é considerada uma doença com risco de vida em todo o mundo. A infecção crônica pelo VHB é carregada de risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular1. O tratamento anti-HBV atual concentra-se principalmente na entrada pós-viral usando análogos de nucleos(t)ide (NAs) e interferon-alfa (IFN-α)2,3. A descoberta de um inibidor da entrada do VHB, o Myrcludex B, identificou um novo alvo para os agentes anti-VHB4. A combinação de inibidores de entrada e NAs no HBV crônico diminuiu significativamente a carga viral em comparação com aqueles que visam apenas a replicação viral 5,6. No entanto, o modelo clássico de hepatócitos para a triagem de inibidores da entrada do HBV é limitado por baixos níveis de receptores virais (polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, NTCP). A superexpressão de hNTCP em células de hepatoma (ou seja, HepG2 e Huh7) melhora a infectividade do HBV 7,8. No entanto, essas linhagens celulares expressam baixos níveis de enzimas metabolizadoras de drogas de fase I e II e apresentam instabilidade genética9. Modelos de hepatócitos que podem ajudar a direcionar mecanismos distintos de compostos anti-HBV candidatos, como entrada pré-viral, ligação ao NTCP e entrada viral, agilizariam a identificação e o desenvolvimento de regimes de combinação eficazes. O estudo para a atividade anti-HBV da curcumina elucidou a inibição da entrada viral como um novo mecanismo, além da interrupção da entrada pós-viral. Este protocolo detalha um modelo hospedeiro para a triagem de moléculas de entrada anti-HBV10.

O objetivo deste método é explorar compostos anti-HBV candidatos para inibição da entrada viral, especialmente bloqueando a ligação e o transporte de NTCP. Como a expressão de NTCP é um fator crítico para a entrada e infecção pelo HBV, otimizamos o protocolo de maturação de hepatócitos para maximizar os níveis de NTCP11. Além disso, esse protocolo pode diferenciar o efeito inibitório sobre a entrada do HBV como inibição da ligação do HBV versus inibição da internalização. O ensaio de captação de ácido taurocólico (TCA) também foi modificado usando um método baseado em ELISA em vez de um radioisótopo para representar o transporte de NTCP12,13. A interação receptor e ligante foi confirmada por suas estruturas 3D14,15. A inibição da função NTCP pode ser avaliada pela mensuração da atividade de captação do TCA16. No entanto, esta técnica não forneceu evidências diretas de ligação do NTCP aos inibidores candidatos. Portanto, a ligação pode ser investigada usando várias técnicas, como ressonância plasmônicade superfície 17, ELISA, ensaio de deslocamento térmico baseado em fluorescência (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen e vários outros métodos20. Dentre essas técnicas, a ITC é um padrão de meta na análise de ligação, pois pode observar absorção ou emissão de calor em quase todas as reações21. A afinidade de ligação (KD) do NTCP e dos compostos candidatos foi avaliada diretamente por meio do ITC; esses valores de afinidade foram mais precisos do que os obtidos por meio do modelo de predição in silico 22.

Este protocolo abrange técnicas de maturação de hepatócitos, infecção por HBV e triagem para inibidor de entrada de HBV. Resumidamente, um modelo de hepatócitos foi desenvolvido com base em linhagens celulares imHC e HepaRG. As células cultivadas foram diferenciadas em hepatócitos maduros dentro de 2 semanas. A regulação positiva dos níveis de NTCP foi detectada por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo11. O virion da hepatite B (HBVcc) foi produzido e coletado da HepG2.2.15. O imHC ou HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) foi tratado profilaticamente com os candidatos anti-HBV 2 h antes da inoculação com virion HBV. O resultado esperado do experimento foi a identificação dos agentes que diminuem o HBV celular e a infectividade. A atividade anti-NTCP foi avaliada usando o ensaio de captação de TCA. A atividade do NTCP pode ser suprimida pelos agentes que vincularam especificamente o NTCP. A técnica ITC foi empregada para investigar a viabilidade de ligações interativas que pudessem predizer inibidores e suas proteínas-alvo, determinando a afinidade de ligação (KD) do ligante pelo receptor via interações não covalentes do complexo biomolecular23,24. Por exemplo, K D ≥ 1 × 103 mM representa ligação fraca, K D ≥ 1 × 106 μM representa ligação moderada e K D ≤ 1 × 109 nM representa ligação forte. O ΔG está diretamente correlacionado com as interações de ligação. Em particular, uma reação com ΔG negativo é uma reação exergônica, indicando que a ligação é um processo espontâneo. Uma reação com um ΔH negativo indica que os processos de ligação dependem da ligação de hidrogênio e das forças de Van der Waals. Tanto a aceitação do TCA quanto os dados do ITC podem ser usados para rastrear agentes de entrada anti-HBV. Os resultados desses protocolos podem fornecer uma base não apenas para a triagem anti-HBV, mas também para a interação com o NTCP, conforme avaliado por meio da afinidade de ligação e da função de transporte. Este trabalho descreve a preparação e caracterização da célula hospedeira, o desenho experimental e a avaliação da entrada anti-HBV, juntamente com a afinidade de ligação do NTCP.

Protocol

NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados num exaustor de fluxo de risco biológico de classe II ou num exaustor de fluxo laminar. O manuseio do HBV foi eticamente aprovado pelo IRB (MURA2020/1545). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todas as soluções, reagentes, equipamentos e linhas celulares usadas neste protocolo. 1. Preparação das células hospedeiras (hepatócitos maduros) Cultivar hepatócitos (3,75 × 10<…

Representative Results

Foram observadas características de maturação hepática, incluindo células binucleadas e morfologia poligonal (Figura 1), especialmente no estágio diferenciado do imHC (Figura 1A). Um grande aumento na expressão de NTCP foi medido em d-HepaRG e d-imHC em 7 e 40 vezes, respectivamente (Figura 1B). A forma altamente glicosilada do NTCP, postulada para conferir suscetibilidade à entrada do HBV, foi detectada mais no d-imHC do qu…

Discussion

A infecção pelo VHB é iniciada via ligação de baixa afinidade aos proteoglicanos do sulfato de heparano (HSPGs) nos hepatócitos25, seguida pela ligação ao NTCP com subsequente internalização por endocitose26. Como o NTCP é um receptor crucial para a entrada no HBV, a segmentação da entrada no HBV pode ser clinicamente traduzida para diminuir a infecção de novo, a transmissão de mãe para filho (MTCT) e a recorrência após o transplante hepático. I…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto de pesquisa é apoiado pela Universidade Mahidol e pela Tailândia Science Research and Innovation (TSRI) separadamente concedido a A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Gabinete do Conselho Nacional de Política de Investigação e Inovação em Ciências do Ensino Superior através da Unidade de Gestão do Programa para a Competitividade (número de subvenção C10F630093). A. Wongkajornsilp é um destinatário de uma bolsa Chalermprakiat da Faculdade de Medicina Hospital Siriraj, Universidade Mahidol. Os autores gostariam de agradecer à Srta. Sawinee Seemakhan (Excelente Centro de Descoberta de Drogas, Faculdade de Ciências, Universidade Mahidol) por sua assistência com a técnica ITC.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

Referanslar

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

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