Özet

Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico

Published: May 10, 2022
doi:

Özet

Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l’affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L’efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).

Abstract

L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è stata considerata un fattore di rischio cruciale per il carcinoma epatocellulare. Il trattamento attuale può solo ridurre la carica virale ma non provocare una remissione completa. Un modello epatocitario efficiente per l’infezione da HBV offrirebbe un ciclo di vita virale realistico che sarebbe cruciale per lo screening degli agenti terapeutici. La maggior parte degli agenti anti-HBV disponibili si rivolge alle fasi del ciclo di vita dopo l’ingresso virale, ma non prima dell’ingresso virale. Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di un modello di epatociti competente in grado di selezionare gli agenti terapeutici mirati alle fasi del ciclo di vita dell’ingresso pre-virale e post-virale. Ciò include il targeting del legame del polipeptide cotrasportatore di taurocolato di sodio (NTCP), la formazione del cccDNA, la trascrizione e l’assemblaggio virale basato su imHC o HepaRG come cellule ospiti. Qui, il test di inibizione dell’ingresso HBV ha utilizzato la curcumina per inibire il legame e le funzioni di trasporto dell’HBV tramite NTCP. Gli inibitori sono stati valutati per l’affinità di legame (KD) con NTCP utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), uno strumento universale per lo screening dei farmaci HBV basato su parametri termodinamici.

Introduction

L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L’infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare1. L’attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull’ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)2,3. La scoperta di un inibitore dell’ingresso dell’HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV4. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell’HBV cronico ha ridotto significativamente la carica virale rispetto a quelli mirati alla sola replicazione virale 5,6. Tuttavia, il modello classico di epatociti per lo screening degli inibitori dell’ingresso dell’HBV è limitato da bassi livelli di recettori virali (polipeptide di cotrasporto del taurocolato di sodio, NTCP). La sovraespressione di hNTCP nelle cellule di epatoma (cioè HepG2 e Huh7) migliora l’infettività dell’HBV 7,8. Tuttavia, queste linee cellulari esprimono bassi livelli di enzimi che metabolizzano i farmaci di fase I e II e mostrano instabilità genetica9. I modelli di epatociti che possono aiutare a colpire meccanismi distinti di composti anti-HBV candidati come l’ingresso previrale, il legame NTCP e l’ingresso virale accelererebbero l’identificazione e lo sviluppo di regimi di combinazione efficaci. Lo studio per l’attività anti-HBV della curcumina ha chiarito l’inibizione dell’ingresso virale come un nuovo meccanismo oltre all’interruzione post-ingresso virale. Questo protocollo descrive un modello ospite per lo screening delle molecole di ingresso anti-HBV10.

L’obiettivo di questo metodo è quello di esplorare i composti anti-HBV candidati per l’inibizione dell’ingresso virale, in particolare bloccando il legame e il trasporto NTCP. Poiché l’espressione di NTCP è un fattore critico per l’ingresso e l’infezione da HBV, abbiamo ottimizzato il protocollo di maturazione degli epatociti per massimizzare i livelli di NTCP11. Inoltre, questo protocollo può differenziare l’effetto inibitorio sull’ingresso dell’HBV come inibizione dell’attaccamento dell’HBV rispetto all’inibizione dell’internalizzazione. Anche il test di assorbimento dell’acido taurocolico (TCA) è stato modificato utilizzando un metodo basato su ELISA anziché un radioisotopo per rappresentare il trasporto NTCP12,13. L’interazione tra recettore e ligando è stata confermata dalle loro strutture 3D14,15. L’inibizione della funzione NTCP può essere valutata misurando l’attività di captazione del TCA16. Tuttavia, questa tecnica non ha fornito prove dirette del legame NTCP ai candidati inibitori. Pertanto, il legame può essere studiato utilizzando varie tecniche, come la risonanza plasmonica di superficie 17, ELISA, saggio di spostamento termico basato sulla fluorescenza (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen e vari altri metodi20. Tra queste tecniche, l’ITC è uno standard obiettivo nell’analisi di legame perché può osservare l’assorbimento o l’emissione di calore in quasi tutte le reazioni21. L’affinità di legame (KD) di NTCP e composti candidati è stata valutata direttamente utilizzando ITC; Questi valori di affinità erano più precisi di quelli ottenuti utilizzando il modello di previsione in silico 22.

Questo protocollo copre le tecniche di maturazione degli epatociti, l’infezione da HBV e lo screening per l’inibitore dell’ingresso dell’HBV. In breve, è stato sviluppato un modello di epatociti basato su linee cellulari imHC e HepaRG. Le cellule coltivate sono state differenziate in epatociti maturi entro 2 settimane. La sovraregolazione dei livelli di NTCP è stata rilevata utilizzando la PCR in tempo reale, il western blot e la citometria a flusso11. Il virione dell’epatite B (HBVcc) è stato prodotto e raccolto da HepG2.2.15. L’imHC differenziato o HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) è stato trattato profilatticamente con i candidati anti-HBV 2 ore prima dell’inoculazione con il virione HBV. Il risultato atteso dell’esperimento era l’identificazione degli agenti che riducono l’HBV cellulare e l’infettività. L’attività anti-NTCP è stata valutata utilizzando il test di assorbimento TCA. L’attività NTCP potrebbe essere soppressa dagli agenti che hanno associato specificamente NTCP. La tecnica ITC è stata impiegata per studiare la fattibilità di un legame interattivo che potrebbe prevedere gli inibitori e le loro proteine bersaglio, determinando l’affinità di legame (KD) del ligando per il recettore attraverso interazioni non covalenti del complesso biomolecolare23,24. Ad esempio, K D ≥ 1 × 103 mM rappresenta il legame debole, K D ≥ 1 × 106 μM rappresenta un legame moderato e K D ≤ 1 × 109 nM rappresenta un legame forte. Il ΔG è direttamente correlato con le interazioni di legame. In particolare, una reazione con ΔG negativo è una reazione esoergonica, che indica che il legame è un processo spontaneo. Una reazione con un ΔH negativo indica che i processi di legame dipendono dal legame idrogeno e dalle forze di Van der Waals. Sia l’assorbimento del TCA che i dati ITC potrebbero essere utilizzati per lo screening degli agenti di ingresso anti-HBV. I risultati di questi protocolli possono fornire una base non solo per lo screening anti-HBV, ma anche per l’interazione con NTCP valutata attraverso l’affinità di legame e la funzione di trasporto. Questo articolo descrive la preparazione e la caratterizzazione della cellula ospite, il disegno sperimentale e la valutazione dell’ingresso anti-HBV insieme all’affinità di legame NTCP.

Protocol

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in una cappa di flusso di pericolo biologico di classe II o in una cappa a flusso laminare. La gestione dell’HBV è stata eticamente approvata dall’IRB (MURA2020/1545). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutte le soluzioni, i reagenti, le apparecchiature e le linee cellulari utilizzate in questo protocollo. 1. Preparazione delle cellule ospiti (epatociti maturi) Epatociti di coltura (3…

Representative Results

Sono state osservate caratteristiche di maturazione epatica, tra cui cellule binucleate e morfologia di forma poligonale (Figura 1), specialmente nello stadio differenziato di imHC (Figura 1A). Un grande aumento dell’espressione di NTCP è stato misurato in d-HepaRG e d-imHC rispettivamente a 7 volte e 40 volte (Figura 1B). La forma altamente glicosilata di NTCP, postulata per conferire suscettibilità all’ingresso dell’HBV, è stat…

Discussion

L’infezione da HBV viene avviata attraverso il legame a bassa affinità ai proteoglicani dell’eparan solfato (HSPG) sugli epatociti25, seguito dal legame a NTCP con successiva internalizzazione attraverso l’endocitosi26. Poiché NTCP è un recettore cruciale per l’ingresso dell’HBV, l’ingresso mirato all’HBV può essere clinicamente tradotto per ridurre l’infezione de novo , la trasmissione madre-figlio (MTCT) e la recidiva dopo trapianto di fegato. Interrompere l’…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto di ricerca è supportato dalla Mahidol University e dalla Thailand Science Research and Innovation (TSRI) assegnati separatamente ad A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall’Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council attraverso il Program Management Unit for Competitiveness (numero di sovvenzione C10F630093). A. Wongkajornsilp ha ricevuto una borsa di studio Chalermprakiat della Facoltà di Medicina Siriraj Hospital, Mahidol University. Gli autori desiderano ringraziare Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) per la sua assistenza con la tecnica ITC.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

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