治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で生命を脅かす病気と見なされています。慢性HBV感染症は、肝硬変と肝細胞癌のリスクを伴います¹。現在の抗HBV治療は、主にヌクレオス(t)イド類似体(NA)およびインターフェロンアルファ(IFN-α^)2,3を使用したウイルス侵入後に焦点を当てています。HBV侵入阻害剤であるミルクルデックスBの発見により、抗HBV薬の新規標的が特定されました⁴。慢性HBVにおける侵入阻害剤とNAの組み合わせは、ウイルス複製のみを標的とするウイルス量と比較してウイルス量を大幅に減少させました^5,6。しかしながら、HBV侵入阻害剤のスクリーニングのための古典的な肝細胞モデルは、低いウイルス受容体レベル(タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド、NTCP)によって制限される。肝癌細胞(すなわち、HepG2およびHuh7)におけるhNTCPの過剰発現は、HBV感染性を改善する^7,8。それにもかかわらず、これらの細胞株は低レベルの第I相および第II相薬物代謝酵素を発現し、遺伝的不安定性を示します⁹。前ウイルス侵入、NTCP結合、ウイルス侵入など、候補抗HBV化合物の明確なメカニズムを標的とするのに役立つ肝細胞モデルは、効果的な併用レジメンの同定と開発を促進します。クルクミンの抗HBV活性の研究は、ウイルス侵入後の中断に加えて、新しいメカニズムとしてウイルス侵入の抑制を解明しました。このプロトコルは、抗HBV侵入分子¹⁰のスクリーニングのための宿主モデルを詳述する。

この方法の目的は、ウイルス侵入阻害、特にNTCP結合および輸送の遮断のための候補となる抗HBV化合物を探索することです。NTCP発現はHBVの侵入と感染にとって重要な要素であるため、NTCPレベルを最大化するために肝細胞成熟プロトコルを最適化しました¹¹。さらに、このプロトコルは、HBV侵入に対する阻害効果を、HBV付着の阻害対内在化の阻害として区別することができる。タウロコール酸(TCA)取り込みアッセイも、NTCP輸送を表すために放射性同位元素の代わりにELISAベースの方法を用いて改変された^12,13。受容体とリガンドの相互作用は、それらの3D構造によって確認された^14,15。NTCP機能の阻害は、TCA取り込み活性を測定することによって評価することができる¹⁶。しかしながら、この技術は、候補阻害剤へのNTCP結合の直接的な証拠を提供しなかった。したがって、結合は、表面プラズモン共鳴¹⁷、ELISA、蛍光ベースの熱シフトアッセイ(FTSA)¹⁸、FRET¹⁹、AlphaScreen、および他の様々な方法²⁰などの様々な技術を用いて調べることができる。これらの手法の中でも、ITCはほぼすべての反応²¹において熱吸収または発光を観察できるため、結合解析における目標標準である。NTCPと候補化合物の結合親和性_(KD)は、ITCを用いて直接評価した。これらの親和性値は、in silico予測モデル²²を用いて得られた値よりも正確であった。

このプロトコルは、肝細胞の成熟、HBV感染、およびHBV侵入阻害剤のスクリーニングにおける技術をカバーしています。簡単に説明すると、肝細胞モデルは、imHCおよびHepaRG細胞株に基づいて開発された。培養細胞は2週間以内に成熟肝細胞に分化した。NTCPレベルのアップレギュレーションは、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、およびフローサイトメトリーを使用して検出されました¹¹。B型肝炎ビリオン(HBVcc)が産生され、HepG2.2.15から収集されました。分化したimHCまたはHepaRG(d-imHC、d-HepaRG)を、HBVビリオンの接種2時間前に抗HBV候補で予防的に処理した。実験の期待される結果は、細胞のHBVと感染力を低下させる薬剤の特定でした。抗NTCP活性は、TCA取り込みアッセイを用いて評価した。NTCP活性は、NTCPを特異的に結合した薬剤によって抑制され得る。ITC技術は、生体分子複合体の非共有結合相互作用を介して受容体に対するリガンドの結合親和性_(KD)を決定し、阻害剤とその標的タンパク質を予測できる相互作用的結合の実現可能性を調べるために採用されました^23,24。例えば、K_D ≥ 1 ×^{10 3} mMは弱い結合を表し、K D ≥ 1 × 10⁶ μMは中程度の結合を表し、K_D ≤ 1 × 10⁹ nMは強い結合を表す。ΔGは結合相互作用と直接相関しています。特に、負のΔGとの反応はエクセルゴニック反応であり、結合が自発的なプロセスであることを示す。負のΔHとの反応は、結合プロセスが水素結合とファンデルワールス力に依存することを示します。TCA取り込みとITCデータの両方を使用して、抗HBVエントリーエージェントをスクリーニングすることができます。これらのプロトコルの結果は、抗HBVスクリーニングだけでなく、結合親和性と輸送機能を通じて評価されるNTCPとの相互作用の基礎も提供できます。この論文では、宿主細胞の調製と特性評価、実験デザイン、および抗HBVエントリーの評価とNTCP結合親和性について説明します。