Özet

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Published: May 10, 2022
doi:

Özet

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Abstract

Hepatitis B-virus (HBV) infectie is beschouwd als een cruciale risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De huidige behandeling kan alleen de virale lading verminderen, maar niet resulteren in volledige remissie. Een efficiënt hepatocytenmodel voor HBV-infectie zou een levensechte virale levenscyclus bieden die cruciaal zou zijn voor de screening van therapeutische middelen. De meeste beschikbare anti-HBV-middelen richten zich op levenscyclusstadia na virale binnenkomst, maar niet vóór virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft de generatie van een competent hepatocytenmodel dat in staat is om te screenen op therapeutische middelen gericht op pre-virale entry en post viral entry lifecycle stadia. Dit omvat de targeting van natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage op basis van imHC of HepaRG als gastheercellen. Hier gebruikte de HBV-entry-inhibitietest curcumine om HBV-bindings- en transportfuncties via NTCP te remmen. De remmers werden geëvalueerd op bindingsaffiniteit (KD) met NTCP met behulp van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) – een universeel hulpmiddel voor HBV-geneesmiddelenscreening op basis van thermodynamische parameters.

Introduction

Hepatitis B-virus (HBV) infectie wordt wereldwijd beschouwd als een levensbedreigende ziekte. Chronische HBV-infectie is beladen met een risico op levercirrose en hepatocellulair carcinoom1. De huidige anti-HBV-behandeling richt zich vooral op post-virale entry met behulp van nucleos(t)ide analogen (NAs) en interferon-alfa (IFN-α)2,3. De ontdekking van een HBV-entryremmer, Myrcludex B, heeft een nieuw doelwit voor anti-HBV-middelen geïdentificeerd4. De combinatie van entryremmers en NA’s bij chronische HBV heeft de virale lading aanzienlijk verminderd in vergelijking met die gericht op virale replicatie alleen 5,6. Het klassieke hepatocytenmodel voor de screening van HBV-entryremmers wordt echter beperkt door lage virale receptorniveaus (natrium taurocholaat cotransporting polypeptide, NTCP). De overexpressie van hNTCP in hepatoomcellen (d.w.z. HepG2 en Huh7) verbetert de HBV-infectiviteit 7,8. Niettemin drukken deze cellijnen lage niveaus van fase I- en II-enzymen uit die geneesmiddelen metaboliseren en vertonen ze genetische instabiliteit9. Hepatocytenmodellen die kunnen helpen bij het richten op verschillende mechanismen van kandidaat-anti-HBV-verbindingen zoals previrale invoer, NTCP-binding en virale entry, zouden de identificatie en ontwikkeling van effectieve combinatieregimes versnellen. De studie voor anti-HBV-activiteit van curcumine heeft de remming van virale entry opgehelderd als een nieuw mechanisme naast onderbreking van de post-virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft een gastheermodel voor de screening van anti-HBV-ingangsmoleculen10.

Het doel van deze methode is om kandidaat-anti-HBV-verbindingen te onderzoeken voor virale entry-remming, met name het blokkeren van NTCP-binding en transport. Omdat NTCP-expressie een kritieke factor is voor HBV-invoer en -infectie, hebben we het hepatocytenrijpingsprotocol geoptimaliseerd om NTCP-niveaus11 te maximaliseren. Bovendien kan dit protocol het remmende effect op HBV-entry differentiëren als remming van HBV-aanhechting versus remming van internalisatie. De taurocholzuur (TCA) opnametest werd ook aangepast met behulp van een ELISA-gebaseerde methode in plaats van een radio-isotoop om NTCP-transport12,13 weer te geven. De receptor- en ligandinteractie werd bevestigd door hun 3D-structuren14,15. De remming van de NTCP-functie kan worden geëvalueerd door TCA-opnameactiviteit16 te meten. Deze techniek leverde echter geen direct bewijs van NTCP-binding aan de kandidaat-remmers. Daarom kan de binding worden onderzocht met behulp van verschillende technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie17, ELISA, fluorescentie-gebaseerde thermische verschuivingstest (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen en verschillende andere methoden20. Onder deze technieken is ITC een doelstandaard in bindingsanalyse omdat het warmteabsorptie of -emissie in bijna elke reactie kan observeren21. De bindingsaffiniteit (KD) van NTCP en kandidaat-verbindingen werd direct geëvalueerd met behulp van ITC; deze affiniteitswaarden waren nauwkeuriger dan die verkregen met behulp van het in silico voorspellingsmodel22.

Dit protocol heeft betrekking op technieken in hepatocytenrijping, HBV-infectie en screening op HBV-entryremmer. In het kort werd een hepatocytenmodel ontwikkeld op basis van imHC- en HepaRG-cellijnen. De gekweekte cellen werden binnen 2 weken gedifferentieerd tot volwassen hepatocyten. De upregulatie van NTCP-niveaus werd gedetecteerd met behulp van real-time PCR, western blot en flowcytometrie11. Hepatitis B-virion (HBVcc) werd geproduceerd en verzameld uit HepG2.2.15. De gedifferentieerde imHC of HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) werd profylactisch behandeld met de anti-HBV-kandidaten 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV-virion. De verwachte uitkomst van het experiment was de identificatie van de middelen die cellulaire HBV en infectiviteit verminderen. Anti-NTCP-activiteit werd geëvalueerd met behulp van de TCA-opnametest. NTCP-activiteit kan worden onderdrukt door de agenten die specifiek NTCP hebben gebonden. De ITC-techniek werd gebruikt om de haalbaarheid te onderzoeken van interactieve binding die remmers en hun doeleiwitten kon voorspellen, waarbij de bindingsaffiniteit (KD) van het ligand voor de receptor werd bepaald via niet-covalente interacties van het biomoleculaire complex23,24. KD ≥ 1 × 103 mM staat bijvoorbeeld voor een zwakke binding, KD ≥ 1 × 106 μM voor matige binding en KD ≤ 1 × 109 nM voor een sterke binding. De ΔG is direct gecorreleerd met bindingsinteracties. In het bijzonder is een reactie met negatieve ΔG een exergonische reactie, wat aangeeft dat binding een spontaan proces is. Een reactie met een negatieve ΔH geeft aan dat de bindingsprocessen afhankelijk zijn van waterstofbinding en Van der Waalskrachten. Zowel TCA-opname- als ITC-gegevens kunnen worden gebruikt om te screenen op anti-HBV-entry agents. De uitkomsten van deze protocollen kunnen een basis vormen voor niet alleen anti-HBV-screening, maar ook voor de interactie met NTCP zoals beoordeeld door bindingsaffiniteit en transportfunctie. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en karakterisering van gastheercellen, experimenteel ontwerp en evaluatie van de anti-HBV-ingang samen met de NTCP-bindingsaffiniteit.

Protocol

OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II biologische gevarenstroomkap of een laminaire stromingskap. De behandeling van HBV is ethisch goedgekeurd door de IRB (MURA2020/1545). Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle oplossingen, reagentia, apparatuur en cellijnen die in dit protocol worden gebruikt. 1. Het voorbereiden van gastheercellen (volwassen hepatocyten) Kweekhepatocyten (3,75 × 105</…

Representative Results

Hepatische rijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaalvormige morfologie (figuur 1), vooral in het gedifferentieerde stadium van imHC (figuur 1A). Een grote toename van NTCP-expressie werd gemeten in d-HepaRG en d-imHC bij respectievelijk 7-voudig en 40-voudig (figuur 1B). De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP, waarvan wordt gepostuleerd dat deze vatbaar is voor HBV-entry, werd meer gedetecteerd…

Discussion

HBV-infectie wordt geïnitieerd via binding met lage affiniteit aan heparansulfaatproteoglycanen (HSPG’s) op hepatocyten25, gevolgd door de binding aan NTCP met daaropvolgende internalisatie via endocytose26. Aangezien NTCP een cruciale receptor is voor HBV-entry, kan targeting hbv-entry klinisch worden vertaald om de novo infectie, moeder-op-kindtransmissie (MTCT) en recidief na levertransplantatie te verminderen. Het onderbreken van virale invoer zou een haalbare…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoeksproject wordt ondersteund door Mahidol University en de Thailand Science Research and Innovation (TSRI) afzonderlijk toegekend aan A. Wongkajornsilp en K. Sa-ngiamsuntorn. Dit werk werd financieel ondersteund door het Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council via de Program Management Unit for Competitiveness (subsidienummer C10F630093). A. Wongkajornsilp is een ontvanger van een Chalermprakiat-beurs van de Faculteit der Geneeskunde Siriraj Hospital, Mahidol University. De auteurs willen miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) bedanken voor haar hulp bij de ITC-techniek.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

Referanslar

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

View Video