JoVE Journal > Biochemistry
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Otomatik Çeviri
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biyokimya

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63761
, , , ,
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy,Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital,Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science,Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science,Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital,Mahidol University

Özet

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간세포암의 중요한 위험 요소로 간주되어 왔습니다. 현재의 치료는 바이러스 부하를 줄일 수 있을 뿐 완전한 관해를 초래하지는 않습니다. HBV 감염에 대한 효율적인 간세포 모델은 치료제 스크리닝에 중요한 실제 바이러스 수명 주기를 제공할 것입니다. 대부분의 사용 가능한 항 HBV 제제는 바이러스 진입 후 수명주기 단계를 목표로하지만 바이러스 진입 전에는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 바이러스 진입 전 및 바이러스 진입 후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝할 수 있는 유능한 간세포 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 여기에는 숙주 세포로서 imHC 또는 HepaRG를 기반으로 하는 나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드(NTCP) 결합, cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 조립의 표적화가 포함됩니다. 여기서, HBV 진입 억제 분석은 NTCP를 통한 HBV 결합 및 수송 기능을 억제하기 위해 커큐민을 사용하였다. 억제제는 열역학적 파라미터에 기초한 HBV 약물 스크리닝을 위한 범용 도구인 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 NTCP와의 결합 친화도(KD)에 대해 평가되었습니다.

Introduction

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 생명을 위협하는 질병으로 간주됩니다. 만성 HBV 감염은 간경변 및 간세포 암종1의 위험이 있습니다. 현재의 항 HBV 치료는 주로 핵 (t) ide 유사체 (NA) 및 인터페론 알파 (IFN-α)2,3를 사용한 바이러스 후 진입에 중점을 둡니다. HBV 진입 억제제 인 Myrcludex B의 발견은 항 HBV 제제4에 대한 새로운 표적을 확인했습니다. 만성 HBV에서 진입 억제제와 NA의 조합은 바이러스복제 단독을 표적으로 하는 것에 비해 바이러스 부하를 유의하게 감소시켰습니다5,6. 그러나, HBV 진입 억제제의 스크리닝을위한 고전적인 간세포 모델은 낮은 바이러스 수용체 수준 (나트륨 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드, NTCP)에 의해 제한된다. 간암 세포(즉, HepG2 및 Huh7)에서 hNTCP의 과발현은 HBV 감염성을 개선합니다 7,8. 그럼에도 불구하고, 이들 세포주는 낮은 수준의 I 및 II 상 약물 대사 효소를 발현하고 유전 적 불안정성을 나타낸다9. 전바이러스 진입, NTCP 결합 및 바이러스 진입과 같은 후보 항-HBV 화합물의 뚜렷한 메커니즘을 표적으로 하는 데 도움이 될 수 있는 간세포 모델은 효과적인 조합 요법의 식별 및 개발을 촉진할 것입니다. 커큐민의 항 HBV 활성에 대한 연구는 바이러스 진입 중단 후 새로운 메커니즘으로서 바이러스 진입 억제를 해명했습니다. 이 프로토콜은 항-HBV 진입 분자10의 스크리닝을 위한 숙주 모델을 상세히 설명한다.

이 방법의 목표는 바이러스 진입 억제, 특히 NTCP 결합 및 수송 차단을 위한 후보 항-HBV 화합물을 탐색하는 것입니다. NTCP 발현은 HBV 진입 및 감염에 중요한 요소이므로 NTCP 수준11을 최대화하기 위해 간세포 성숙 프로토콜을 최적화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 HBV 진입에 대한 억제 효과를 HBV 부착의 억제 대 내재화의 억제로서 구별할 수 있다. 타우로 콜산 (TCA) 흡수 분석은 또한 NTCP 수송12,13을 나타 내기 위해 방사성 동위 원소 대신 ELISA 기반 방법을 사용하여 변형되었습니다. 수용체와 리간드 상호작용은 이들의 3D 구조14,15에 의해 확인되었다. NTCP 기능의 억제는 TCA 흡수 활성(16)을 측정함으로써 평가할 수 있다. 그러나, 이 기술은 후보 억제제에 대한 NTCP 결합의 직접적인 증거를 제공하지 않았다. 따라서, 결합은 다양한 기술, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(17), ELISA, 형광-기반 열 이동 분석(FTSA)18, FRET19, 알파스크린(AlphaScreen) 및 다양한 다른 방법(20)을 사용하여 조사될 수 있다. 이들 기술 중에서, ITC는 거의 모든 반응에서 열 흡수 또는 방출을 관찰할 수 있기 때문에 결합 분석의 목표 표준이다(21). NTCP와 후보 화합물의 결합 친화도(KD)는 ITC를 사용하여 직접 평가되었습니다. 이들 친화도 값은 In Silico 예측 모델22를 사용하여 수득된 값보다 더 정확하였다.

이 프로토콜은 간세포 성숙, HBV 감염 및 HBV 진입 억제제 스크리닝 기술을 다룹니다. 간단히 말해서, 간세포 모델은 imHC 및 HepaRG 세포주를 기반으로 개발되었습니다. 배양된 세포는 2주 이내에 성숙한 간세포로 분화되었다. NTCP 수준의 상향 조절은 real-time PCR, 웨스턴 블롯 및 유세포분석11을 사용하여 검출하였다. B형 간염 비리온(HBVcc)을 생산하고 HepG2.2.15로부터 수집하였다. 분화된 imHC 또는 HepaRG (d-imHC, d-HepaRG)를 HBV 비리온으로 접종하기 2시간 전에 항-HBV 후보로 예방적으로 처리하였다. 실험의 예상 결과는 세포 HBV와 감염성을 감소시키는 약제의 확인이었습니다. 항-NTCP 활성은 TCA 흡수 분석을 사용하여 평가하였다. NTCP 활동은 NTCP를 구체적으로 바인딩한 에이전트에 의해 억제될 수 있습니다. ITC 기술은 억제제 및 그의 표적 단백질을 예측할 수 있는 상호작용적 결합의 타당성을 조사하기 위해 사용되었고, 생체분자 복합체23,24의 비공유 상호작용을 통해 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 예를 들어, KD≥ 1 × 103 mM은 약한 결합을 나타내고, KD≥ 1 ×10 6 μM은 중간 결합을 나타내고, KD≤ 1 × 109 nM은 강한 결합을 나타낸다. ΔG는 결합 상호 작용과 직접적인 상관 관계가 있습니다. 특히, 음성 ΔG와의 반응은 exergonic 반응이며, 이는 결합이 자발적인 과정임을 나타낸다. 음의 ΔH를 갖는 반응은 결합 과정이 수소 결합과 반 데르 발스 힘에 의존한다는 것을 나타낸다. TCA 섭취 및 ITC 데이터 모두 항 HBV 진입 제제를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 결과는 항 HBV 스크리닝뿐만 아니라 결합 친화도 및 수송 기능을 통해 평가되는 NTCP와의 상호 작용을위한 기초를 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 숙주 세포 준비 및 특성화, 실험 설계 및 NTCP 결합 친화도와 함께 항 -HBV 항목의 평가에 대해 설명합니다.

Protocol

알림: 다음 절차는 Class II 생물학적 위험 흐름 후드 또는 층류 후드에서 수행해야 합니다. HBV의 취급은 IRB (MURA2020/1545)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 용액, 시약, 장비 및 세포주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 1. 숙주세포(성숙간세포) 준비 간세포(3.75 × 105 세포 HepaRG 또는 imHC)를 배?…

Representative Results

특히 imHC의 분화 단계에서 이핵 세포와 다각형 형태 (그림 1)를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다 (그림 1A). NTCP 발현의 큰 증가는 d-HepaRG 및 d-imHC에서 각각 7배 및 40배로 측정되었습니다(그림 1B). HBV 진입에 대한 감수성을 부여하는 것으로 가정 된 NTCP의 고도로 글리코 실화 된 형태는 d-HepaRG보다 d-imHC에서 더 많이 검출되었다 (…

Discussion

HBV 감염은 간세포25 상의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPGs)에 대한 낮은 친화도 결합을 통해 시작되고, 이어서 엔도 사이토 시스26을 통한 후속 내재화와 함께 NTCP에 결합한다. NTCP는 HBV 진입에 중요한 수용체이기 때문에 HBV 진입을 표적으로 하는 것은 임상적으로 번역되어 de novo 감염, 모자 간 전염(MTCT) 및 간 이식 후 재발을 감소시킬 수 있습니다. ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구 프로젝트는 Mahidol University와 태국 과학 연구 및 혁신 (TSRI)이 A. Wongkajornsilp 및 K. Sa-ngiamsuntorn에게 별도로 수여합니다. 이 작업은 경쟁력을위한 프로그램 관리 단위 (보조금 번호 C10F630093)를 통해 국가 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책위원회 사무국에서 재정적으로 지원했습니다. A. Wongkajornsilp는 Mahidol University의 Faculty of Medicine Siriraj Hospital의 Chalermprakiat 보조금을 받았습니다. 저자는 ITC 기술에 대한 그녀의 도움에 대해 Sawinee Seemakhan (Mahidol University 과학 학부 약물 발견 우수 센터)에게 감사드립니다.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Etiketler

Hepatocyte ModelHepatitis B VirusNTCPViral EntryTherapeutic TargetEDTAParaformaldehydeTriton X-100Primary AntibodySecondary AntibodyFlow CytometryCompensation ControlsForward ScatterSide ScatterPMT Voltage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image