Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

L’arginine (R)-méthylation est une modification post-traductionnelle (PTM) qui décore environ 1% du protéome des mammifères¹. Les protéines arginines méthyltransférases (PRMT) sont les enzymes catalysant la réaction de R-méthylation par dépôt d’un ou deux groupes méthyle sur les atomes d’azote (N) du groupe guanidino de la chaîne latérale de R de manière symétrique ou asymétrique. Chez les mammifères, les PRMT peuvent être regroupés en trois classes – type I, type II et type III – en fonction de leur capacité à déposer à la fois la monométhylation (MMA) et la diméthylation asymétrique (ADMA), le MMA et la diméthylation symétrique (SDMA) ou seulement le MMA, respectivement ^2,3. Les PRMT ciblent principalement les résidus R situés dans les régions riches en glycine et en arginine, connus sous le nom de motifs GAR, mais certains PRMT, tels que PRMT5 et CARM1, peuvent méthyler des motifs riches en proline-glycine-méthionine (PGM)⁴. La R-méthylation a émergé comme un modulateur protéique de plusieurs processus biologiques, tels que l’épissage de l’ARN⁵, la réparation de l’ADN⁶, la biogenèse miARN⁷ et la traduction², favorisant la recherche sur ce PTM.

La spectrométrie de masse (SM) est reconnue comme la technologie la plus efficace pour étudier systématiquement la R-méthylation globale à la résolution des protéines, des peptides et des sites. Cependant, ce PTM nécessite certaines précautions particulières pour son identification à haut niveau de confiance par la SEP. Tout d’abord, la R-méthylation est substœchiométrique, la forme non modifiée des peptides étant beaucoup plus abondante que les peptides modifiés, de sorte que les spectromètres de masse fonctionnant en mode d’acquisition dépendante des données (DDA) fragmenteront les peptides non modifiés de haute intensité plus souvent que leurs homologues méthylés de plus faible intensité⁸. De plus, la plupart des flux de travail basés sur MS pour l’identification de sites R-méthylés souffrent de limitations au niveau de l’analyse bioinformatique. En effet, l’identification informatique des peptides méthyliques est sujette à des taux élevés de fausses découvertes (FDR), car ce PTM est isobare à diverses substitutions d’acides aminés (par exemple, la glycine en alanine) et à des modifications chimiques, telles que la méthyl-estérification de l’aspartate et du glutamate⁹. Par conséquent, des méthodes basées sur le marquage isotopique des groupes méthyle, telles que le marquage isotopique stable des méthyles lourds avec des acides aminés en culture cellulaire (hmSILAC), ont été mises en œuvre en tant que stratégies orthogonales pour l’identification sûre des méthylations in vivo par la SM, réduisant considérablement le taux d’annotations faussement positives¹⁰.

Récemment, divers protocoles à l’échelle du protéome pour étudier les protéines R-méthylées ont été optimisés. Le développement de stratégies basées sur les anticorps pour l’enrichissement immuno-affinité des peptides R-méthyl a conduit à l’annotation de plusieurs centaines de sites R-méthylés dans des cellules humaines^11,12. En outre, de nombreuses études ^3,13 ont rapporté que le couplage de l’enrichissement à base d’anticorps avec des techniques de séparation peptidique telles que le fractionnement par chromatographie HpH-RP peut augmenter le nombre total de méthylpeptides identifiés.

Cet article décrit une stratégie expérimentale conçue pour l’identification systématique et à haut niveau de confiance des sites R-méthylés dans les cellules humaines, basée sur diverses étapes biochimiques et analytiques: extraction de protéines à partir de cellules marquées hmSILAC, digestion enzymatique double parallèle avec des protéases de trypsine et de lysarginase, suivie d’un fractionnement chromatographique HpH-RP de peptides digérés, couplé à un enrichissement immuno-affinité à base d’anticorps de MMA-, SDMA-, et les peptides contenant de l’ADMA. Tous les peptides enrichis par affinité sont ensuite analysés par chromatographie liquide (LC)-MS/MS à haute résolution en mode DDA, et les données MS brutes sont traitées par l’algorithme MaxQuant pour l’identification des peptides R-méthyl. Enfin, les résultats de sortie MaxQuant sont traités avec hmSEEKER, un outil bioinformatique développé en interne pour rechercher des paires de méthylpeptides lourds et légers. En bref, hmSEEKER lit et filtre les identifications de méthylpeptides à partir du fichier msms, puis fait correspondre chaque méthylpeptide à son pic MS1 correspondant dans le fichier allPeptides, et, enfin, recherche le pic de la contrepartie peptidique lourde/légère. Pour chaque paire putative lourd-léger, les paramètres Log2 H/L (LogRatio), Retention Time difference (dRT) et Mass Error (ME) sont calculés, et les doublets situés dans les seuils définis par l’utilisateur sont étiquetés comme vrais positifs. Le flux de travail du protocole biochimique est décrit à la figure 1.