Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Die Arginin (R)-Methylierung ist eine posttranslationale Modifikation (PTM), die etwa 1% des Säugetierproteoms¹ verziert. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) sind die Enzyme, die die R-Methylierungsreaktion durch die Ablagerung einer oder zweier Methylgruppen an die Stickstoffatome (N) der Guanidino-Gruppe der Seitenkette von R symmetrisch oder asymmetrisch katalysieren. Bei Säugetieren können PRMTs in drei Klassen eingeteilt werden – Typ I, Typ II und Typ III – abhängig von ihrer Fähigkeit, sowohl Monomethylierung (MMA) als auch asymmetrische Dimethylierung (ADMA), MMA und symmetrische Dimethylierung (SDMA) oder nur MMA bzw. ^2,3 abzuscheiden. PRMTs zielen hauptsächlich auf R-Reste ab, die sich in glycin- und argininreichen Regionen befinden, die als GAR-Motive bekannt sind, aber einige PRMTs, wie PRMT5 und CARM1, können Prolin-Glycin-Methionin-reiche (PGM) -Motive methylieren⁴. Die R-Methylierung hat sich als Proteinmodulator mehrerer biologischer Prozesse wie RNA-Spleißen⁵, DNA-Reparatur⁶, miRNA-Biogenese⁷ und Translation² erwiesen und fördert die Erforschung dieses PTM.

Die Massenspektrometrie (MS) gilt als die effektivste Technologie zur systematischen Untersuchung der globalen R-Methylierung mit Protein-, Peptid- und Ortsauflösung. Dieses PTM erfordert jedoch einige besondere Vorsichtsmaßnahmen für seine hochzuverlässige Identifizierung durch MS. Erstens ist die R-Methylierung substöchiometrisch, wobei die unmodifizierte Form der Peptide viel häufiger ist als die modifizierten, so dass Massenspektrometer, die im DDA-Modus (Data Dependent Acquisition) arbeiten, hochintensive unmodifizierte Peptide häufiger fragmentieren als ihre methylierten Gegenstücke mit geringerer Intensität⁸. Darüber hinaus leiden die meisten MS-basierten Workflows für die Identifizierung von R-methylierten Stellen unter Einschränkungen auf der Ebene der bioinformatischen Analyse. Tatsächlich ist die rechnergestützte Identifizierung von Methylpeptiden anfällig für hohe False Discovery Rates (FDR), da dieses PTM isobar zu verschiedenen Aminosäuresubstitutionen (z. B. Glycin in Alanin) und chemischen Modifikationen wie der Methylesterung von Aspartat und Glutamat⁹ ist. Daher wurden Methoden, die auf der Isotopenmarkierung von Methylgruppen basieren, wie z.B. die Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), als orthogonale Strategien zur sicheren MS-Identifizierung von in vivo Methylierungen implementiert, wodurch die Rate falsch positiver Annotationen signifikant reduziert wird¹⁰.

Vor kurzem wurden verschiedene proteomweite Protokolle zur Untersuchung von R-methylierten Proteinen optimiert. Die Entwicklung von Antikörper-basierten Strategien zur Immunaffinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden hat zur Annotation von mehreren hundert R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen geführt^11,12. Darüber hinaus berichteten viele Studien ^3,13, dass die Kopplung der Antikörper-basierten Anreicherung mit Peptidtrenntechniken wie der HpH-RP-Chromatographie-Fraktionierung die Gesamtzahl der identifizierten Methylpeptide erhöhen kann.

Dieser Artikel beschreibt eine experimentelle Strategie zur systematischen und hochsicheren Identifizierung von R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen, basierend auf verschiedenen biochemischen und analytischen Schritten: Proteinextraktion aus hmSILAC-markierten Zellen, paralleler doppelzymatischer Aufschluss mit Trypsin- und LysargiNase-Proteasen, gefolgt von HpH-RP-chromatographischer Fraktionierung von verdauten Peptiden, gekoppelt mit Antikörper-basierter Immunaffinitätsanreicherung von MMA-, SDMA-, und ADMA-haltige Peptide. Alle affinitätsangereicherten Peptide werden dann mittels hochauflösender Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS im DDA-Modus analysiert, und die MS-Rohdaten werden vom MaxQuant-Algorithmus zur Identifizierung von R-Methylpeptiden verarbeitet. Schließlich werden die MaxQuant-Ausgabeergebnisse mit hmSEEKER verarbeitet, einem selbst entwickelten Bioinformatik-Tool zur Suche nach Paaren schwerer und leichter Methylpeptide. Kurz gesagt, hmSEEKER liest und filtert Methylpeptididentifikationen aus der msms-Datei, gleicht dann jedes Methylpeptid seinem entsprechenden MS1-Peak in der allPeptides-Datei zu und durchsucht schließlich den Peak des schweren/leichten Peptid-Gegenstücks. Für jedes mutmaßliche Schwerlicht-Paar werden die Parameter Log2 H/L-Verhältnis (LogRatio), Retention Time Difference (dRT) und Mass Error (ME) berechnet, und Dubletten, die sich innerhalb benutzerdefinierter Cut-Offs befinden, werden als True Positives gekennzeichnet. Der Arbeitsablauf des biochemischen Protokolls ist in Abbildung 1 beschrieben.