Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

La arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional (PTM) que decora alrededor del 1% del proteoma de mamíferos¹. Las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) son las enzimas que catalizan la reacción de R-metilación por la deposición de uno o dos grupos metilo a los átomos de nitrógeno (N) del grupo guanidino de la cadena lateral de R de manera simétrica o asimétrica. En los mamíferos, los PRMT pueden agruparse en tres clases: tipo I, tipo II y tipo III, dependiendo de su capacidad para depositar tanto monometilación (MMA) como dimetilación asimétrica (ADMA), MMA y dimetilación simétrica (SDMA) o solo MMA, respectivamente ^2,3. Los PRMT se dirigen principalmente a residuos R localizados dentro de regiones ricas en glicina y arginina, conocidos como motivos GAR, pero algunos PRMT, como PRMT5 y CARM1, pueden metilar motivos ricos en prolina-glicina-metionina (PGM)⁴. La R-metilación ha surgido como un modulador de proteínas de varios procesos biológicos, como el empalme de ARN⁵, la reparación del ADN⁶, la biogénesis de miARN⁷ y la traducción², fomentando la investigación sobre este PTM.

La espectrometría de masas (MS) es reconocida como la tecnología más efectiva para estudiar sistemáticamente la R-metilación global en resolución de proteínas, péptidos y sitios. Sin embargo, este PTM requiere algunas precauciones particulares para su identificación de alta confianza por parte del EM. En primer lugar, la R-metilación es subestequiométrica, siendo la forma no modificada de los péptidos mucho más abundante que los modificados, de modo que los espectrómetros de masas que operan en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) fragmentarán péptidos no modificados de alta intensidad con más frecuencia que sus contrapartes metiladas de menor intensidad⁸. Además, la mayoría de los flujos de trabajo basados en EM para la identificación de sitios R-metilados sufren limitaciones a nivel de análisis bioinformático. De hecho, la identificación computacional de péptidos metilo es propensa a altas tasas de descubrimiento falso (FDR), porque este PTM es isobárico a varias sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, glicina en alanina) y modificación química, como la metilesterificación de aspartato y glutamato⁹. Por lo tanto, los métodos basados en el etiquetado de isótopos de grupos metilo, como el etiquetado de isótopos estables de metilo pesado con aminoácidos en cultivo celular (hmSILAC), se han implementado como estrategias ortogonales para la identificación segura de metilaciones in vivo con EM, reduciendo significativamente la tasa de anotaciones falsas positivas¹⁰.

Recientemente, se han optimizado varios protocolos de todo el proteoma para estudiar las proteínas R-metiladas. El desarrollo de estrategias basadas en anticuerpos para el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos ha llevado a la anotación de varios cientos de sitios R-metilados en células humanas^11,12. Además, muchos estudios ^3,13 informaron que el acoplamiento del enriquecimiento basado en anticuerpos con técnicas de separación peptídica como el fraccionamiento por cromatografía HpH-RP puede aumentar el número total de metilpéptidos identificados.

Este artículo describe una estrategia experimental diseñada para la identificación sistemática y de alta confianza de sitios R-metilados en células humanas, basada en varios pasos bioquímicos y analíticos: extracción de proteínas de células marcadas con hmSILAC, digestión enzimática doble paralela con proteasas Trypsin y LysargiNase, seguida de fraccionamiento cromatográfico HpH-RP de péptidos digeridos, junto con enriquecimiento de inmunoafinidad basado en anticuerpos de MMA-, SDMA-, y péptidos que contienen ADMA. Todos los péptidos enriquecidos con afinidad se analizan mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS de alta resolución en modo DDA, y los datos brutos de MS son procesados por el algoritmo MaxQuant para la identificación de péptidos R-metilo. Finalmente, los resultados de salida de MaxQuant se procesan con hmSEEKER, una herramienta bioinformática desarrollada internamente para buscar pares de péptidos metilo pesados y ligeros. Brevemente, hmSEEKER lee y filtra las identificaciones de péptidos metilo del archivo msms, luego compara cada péptido metilo con su pico MS1 correspondiente en el archivo allPeptides y, finalmente, busca el pico de la contraparte del péptido pesado / ligero. Para cada par pesado-ligero putativo, se calculan los parámetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) y Mass Error (ME), y los dobletes que se encuentran dentro de los puntos de corte definidos por el usuario se etiquetan como verdaderos positivos. El flujo de trabajo del protocolo bioquímico se describe en la Figura 1.