Özet

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

Published: April 28, 2022
doi:

Özet

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Abstract

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación post-traduccional de proteínas (PTM) generalizada involucrada en la regulación de varias vías celulares, incluyendo el procesamiento de ARN, la transducción de señales, la respuesta al daño del ADN, la biogénesis de miARN y la traducción.

En los últimos años, gracias a los avances bioquímicos y analíticos, la proteómica basada en la espectrometría de masas (MS) se ha convertido en la estrategia más efectiva para caracterizar el metilproteoma celular con resolución de sitio único. Sin embargo, la identificación y el perfil in vivo de la proteína R-metilación por EM sigue siendo difícil y propenso a errores, principalmente debido a la naturaleza subestequiométrica de esta modificación y la presencia de varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación química de residuos ácidos que son isobáricos a la metilación. Por lo tanto, se requieren métodos de enriquecimiento para mejorar la identificación de R-metilpéptidos y estrategias de validación ortogonal para reducir las tasas de descubrimiento falso (FDR) en estudios de proteómica de metilo.

Aquí, se describe un protocolo diseñado específicamente para la identificación y cuantificación de péptidos R-metilo de alta confianza a partir de muestras celulares, que combina el etiquetado metabólico de las células con metionina codificada en isótopos pesados (hmSILAC) y la digestión dual de proteasa en solución del extracto de células enteras, seguido del fraccionamiento por cromatografía de fase inversa de alto pH (HpH-RP) fuera de línea y el enriquecimiento de afinidad de R-metilpéptidos utilizando anticuerpos anti-pan-R-metilo. Tras el análisis de MS de alta resolución, los datos sin procesar se procesan primero con el paquete de software MaxQuant y los resultados son analizados por hmSEEKER, un software diseñado para la búsqueda en profundidad de pares de picos de MS correspondientes a péptidos de metilo ligeros y pesados dentro de los archivos de salida de MaxQuant.

Introduction

La arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional (PTM) que decora alrededor del 1% del proteoma de mamíferos1. Las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) son las enzimas que catalizan la reacción de R-metilación por la deposición de uno o dos grupos metilo a los átomos de nitrógeno (N) del grupo guanidino de la cadena lateral de R de manera simétrica o asimétrica. En los mamíferos, los PRMT pueden agruparse en tres clases: tipo I, tipo II y tipo III, dependiendo de su capacidad para depositar tanto monometilación (MMA) como dimetilación asimétrica (ADMA), MMA y dimetilación simétrica (SDMA) o solo MMA, respectivamente 2,3. Los PRMT se dirigen principalmente a residuos R localizados dentro de regiones ricas en glicina y arginina, conocidos como motivos GAR, pero algunos PRMT, como PRMT5 y CARM1, pueden metilar motivos ricos en prolina-glicina-metionina (PGM)4. La R-metilación ha surgido como un modulador de proteínas de varios procesos biológicos, como el empalme de ARN5, la reparación del ADN6, la biogénesis de miARN7 y la traducción2, fomentando la investigación sobre este PTM.

La espectrometría de masas (MS) es reconocida como la tecnología más efectiva para estudiar sistemáticamente la R-metilación global en resolución de proteínas, péptidos y sitios. Sin embargo, este PTM requiere algunas precauciones particulares para su identificación de alta confianza por parte del EM. En primer lugar, la R-metilación es subestequiométrica, siendo la forma no modificada de los péptidos mucho más abundante que los modificados, de modo que los espectrómetros de masas que operan en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) fragmentarán péptidos no modificados de alta intensidad con más frecuencia que sus contrapartes metiladas de menor intensidad8. Además, la mayoría de los flujos de trabajo basados en EM para la identificación de sitios R-metilados sufren limitaciones a nivel de análisis bioinformático. De hecho, la identificación computacional de péptidos metilo es propensa a altas tasas de descubrimiento falso (FDR), porque este PTM es isobárico a varias sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, glicina en alanina) y modificación química, como la metilesterificación de aspartato y glutamato9. Por lo tanto, los métodos basados en el etiquetado de isótopos de grupos metilo, como el etiquetado de isótopos estables de metilo pesado con aminoácidos en cultivo celular (hmSILAC), se han implementado como estrategias ortogonales para la identificación segura de metilaciones in vivo con EM, reduciendo significativamente la tasa de anotaciones falsas positivas10.

Recientemente, se han optimizado varios protocolos de todo el proteoma para estudiar las proteínas R-metiladas. El desarrollo de estrategias basadas en anticuerpos para el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos ha llevado a la anotación de varios cientos de sitios R-metilados en células humanas11,12. Además, muchos estudios 3,13 informaron que el acoplamiento del enriquecimiento basado en anticuerpos con técnicas de separación peptídica como el fraccionamiento por cromatografía HpH-RP puede aumentar el número total de metilpéptidos identificados.

Este artículo describe una estrategia experimental diseñada para la identificación sistemática y de alta confianza de sitios R-metilados en células humanas, basada en varios pasos bioquímicos y analíticos: extracción de proteínas de células marcadas con hmSILAC, digestión enzimática doble paralela con proteasas Trypsin y LysargiNase, seguida de fraccionamiento cromatográfico HpH-RP de péptidos digeridos, junto con enriquecimiento de inmunoafinidad basado en anticuerpos de MMA-, SDMA-, y péptidos que contienen ADMA. Todos los péptidos enriquecidos con afinidad se analizan mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS de alta resolución en modo DDA, y los datos brutos de MS son procesados por el algoritmo MaxQuant para la identificación de péptidos R-metilo. Finalmente, los resultados de salida de MaxQuant se procesan con hmSEEKER, una herramienta bioinformática desarrollada internamente para buscar pares de péptidos metilo pesados y ligeros. Brevemente, hmSEEKER lee y filtra las identificaciones de péptidos metilo del archivo msms, luego compara cada péptido metilo con su pico MS1 correspondiente en el archivo allPeptides y, finalmente, busca el pico de la contraparte del péptido pesado / ligero. Para cada par pesado-ligero putativo, se calculan los parámetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) y Mass Error (ME), y los dobletes que se encuentran dentro de los puntos de corte definidos por el usuario se etiquetan como verdaderos positivos. El flujo de trabajo del protocolo bioquímico se describe en la Figura 1.

Protocol

1. Cultivo celular y extracción de proteínas (tiempo: 3 – 4 semanas requeridas) Cultivar células HeLa en paralelo en medios suministrados con metionina ligera (L) o pesada (H), respectivamente (ver Tabla 1 para la composición de los medios). Tras al menos ocho divisiones celulares, recoger una alícuota de células de cada canal SILAC y realizar la prueba de incorporación.NOTA: Para verificar la eficiencia de incorporación, pruebe mediante el análisis LC-MS / MS que el porcentaje de …

Representative Results

El artículo describe un flujo de trabajo para la identificación de alta confianza de la proteína R-metilación global, que se basa en la combinación de la digestión enzimática del extracto de proteína con dos proteasas distintas en paralelo, seguido del fraccionamiento por cromatografía líquida HpH-RP de péptidos proteolíticos y el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos con anticuerpos anti-pan-R-metilo (Figura 1). Las células se cultiv…

Discussion

La identificación de alta confianza de la metilación in vivo de proteínas/péptidos mediante proteómica global basada en EM es un desafío, debido al riesgo de FDR alta, con varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación que ocurren durante la preparación de la muestra que son isobáricas a la metilación y pueden causar asignaciones incorrectas en ausencia de estrategias ortogonales de validación de EM. La naturaleza subestequiométrica de este PTM complica aún más la tarea de la metilprote…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MM y EM son estudiantes de doctorado dentro de la Escuela Europea de Medicina Molecular (SEMM). EM recibe una beca FIRC-AIRC de 3 años (Código del proyecto: 22506). Los análisis globales de R-metil-proteomas en el grupo de TB están respaldados por la subvención AIRC IG (Código del proyecto: 21834).

Materials

Ammonium Bicarbonate (AMBIC) Sigma-Aldrich 09830
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich 497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) Waters WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant Sigma-Aldrich ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free Roche-Sigma Aldrich 11836170001 Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO ThermoFisher 26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 3483-12-3
DMEM Medium GIBCO ThermoFisher requested  with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns ThermoFisher ES907
Glycerolo Sigma-Aldrich G5516
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich 144-48-9
Jupiter C12-RP column Phenomenex 00G-4396-E0
L-Methionine Sigma-Aldrich M5308 Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3) Sigma-Aldrich 299154 Heavy (H) Methionine
LysargiNase Merck Millipore EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Penicillin-Streptomycin GIBCO ThermoFisher 15140122
PhosSTOP Roche-Sigma Aldrich 4906837001 Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips ThermoFisher 87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade ThermoFisher 85175 LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade ThermoFisher 85170 LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade ThermoFisher 51101
Pierce  Water, LC-MS Grade ThermoFisher 51140
Polyacrylamide Sigma-Aldrich 92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610373
PTMScan antibodies α-ADMA Cell Signaling Technology 13474
PTMScan antibodies α-MMA Cell Signaling Technology 12235
PTMScan antibodies α-SDMA Cell Signaling Technology 13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5113
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Urea Sigma-Aldrich U5378
Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Speed vac

Referanslar

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Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis. J. Vis. Exp. (182), e62409, doi:10.3791/62409 (2022).

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