La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.
La proteína arginina (R)-metilación es una modificación post-traduccional de proteínas (PTM) generalizada involucrada en la regulación de varias vías celulares, incluyendo el procesamiento de ARN, la transducción de señales, la respuesta al daño del ADN, la biogénesis de miARN y la traducción.
En los últimos años, gracias a los avances bioquímicos y analíticos, la proteómica basada en la espectrometría de masas (MS) se ha convertido en la estrategia más efectiva para caracterizar el metilproteoma celular con resolución de sitio único. Sin embargo, la identificación y el perfil in vivo de la proteína R-metilación por EM sigue siendo difícil y propenso a errores, principalmente debido a la naturaleza subestequiométrica de esta modificación y la presencia de varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación química de residuos ácidos que son isobáricos a la metilación. Por lo tanto, se requieren métodos de enriquecimiento para mejorar la identificación de R-metilpéptidos y estrategias de validación ortogonal para reducir las tasas de descubrimiento falso (FDR) en estudios de proteómica de metilo.
Aquí, se describe un protocolo diseñado específicamente para la identificación y cuantificación de péptidos R-metilo de alta confianza a partir de muestras celulares, que combina el etiquetado metabólico de las células con metionina codificada en isótopos pesados (hmSILAC) y la digestión dual de proteasa en solución del extracto de células enteras, seguido del fraccionamiento por cromatografía de fase inversa de alto pH (HpH-RP) fuera de línea y el enriquecimiento de afinidad de R-metilpéptidos utilizando anticuerpos anti-pan-R-metilo. Tras el análisis de MS de alta resolución, los datos sin procesar se procesan primero con el paquete de software MaxQuant y los resultados son analizados por hmSEEKER, un software diseñado para la búsqueda en profundidad de pares de picos de MS correspondientes a péptidos de metilo ligeros y pesados dentro de los archivos de salida de MaxQuant.
La arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional (PTM) que decora alrededor del 1% del proteoma de mamíferos1. Las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) son las enzimas que catalizan la reacción de R-metilación por la deposición de uno o dos grupos metilo a los átomos de nitrógeno (N) del grupo guanidino de la cadena lateral de R de manera simétrica o asimétrica. En los mamíferos, los PRMT pueden agruparse en tres clases: tipo I, tipo II y tipo III, dependiendo de su capacidad para depositar tanto monometilación (MMA) como dimetilación asimétrica (ADMA), MMA y dimetilación simétrica (SDMA) o solo MMA, respectivamente 2,3. Los PRMT se dirigen principalmente a residuos R localizados dentro de regiones ricas en glicina y arginina, conocidos como motivos GAR, pero algunos PRMT, como PRMT5 y CARM1, pueden metilar motivos ricos en prolina-glicina-metionina (PGM)4. La R-metilación ha surgido como un modulador de proteínas de varios procesos biológicos, como el empalme de ARN5, la reparación del ADN6, la biogénesis de miARN7 y la traducción2, fomentando la investigación sobre este PTM.
La espectrometría de masas (MS) es reconocida como la tecnología más efectiva para estudiar sistemáticamente la R-metilación global en resolución de proteínas, péptidos y sitios. Sin embargo, este PTM requiere algunas precauciones particulares para su identificación de alta confianza por parte del EM. En primer lugar, la R-metilación es subestequiométrica, siendo la forma no modificada de los péptidos mucho más abundante que los modificados, de modo que los espectrómetros de masas que operan en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) fragmentarán péptidos no modificados de alta intensidad con más frecuencia que sus contrapartes metiladas de menor intensidad8. Además, la mayoría de los flujos de trabajo basados en EM para la identificación de sitios R-metilados sufren limitaciones a nivel de análisis bioinformático. De hecho, la identificación computacional de péptidos metilo es propensa a altas tasas de descubrimiento falso (FDR), porque este PTM es isobárico a varias sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, glicina en alanina) y modificación química, como la metilesterificación de aspartato y glutamato9. Por lo tanto, los métodos basados en el etiquetado de isótopos de grupos metilo, como el etiquetado de isótopos estables de metilo pesado con aminoácidos en cultivo celular (hmSILAC), se han implementado como estrategias ortogonales para la identificación segura de metilaciones in vivo con EM, reduciendo significativamente la tasa de anotaciones falsas positivas10.
Recientemente, se han optimizado varios protocolos de todo el proteoma para estudiar las proteínas R-metiladas. El desarrollo de estrategias basadas en anticuerpos para el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos ha llevado a la anotación de varios cientos de sitios R-metilados en células humanas11,12. Además, muchos estudios 3,13 informaron que el acoplamiento del enriquecimiento basado en anticuerpos con técnicas de separación peptídica como el fraccionamiento por cromatografía HpH-RP puede aumentar el número total de metilpéptidos identificados.
Este artículo describe una estrategia experimental diseñada para la identificación sistemática y de alta confianza de sitios R-metilados en células humanas, basada en varios pasos bioquímicos y analíticos: extracción de proteínas de células marcadas con hmSILAC, digestión enzimática doble paralela con proteasas Trypsin y LysargiNase, seguida de fraccionamiento cromatográfico HpH-RP de péptidos digeridos, junto con enriquecimiento de inmunoafinidad basado en anticuerpos de MMA-, SDMA-, y péptidos que contienen ADMA. Todos los péptidos enriquecidos con afinidad se analizan mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS de alta resolución en modo DDA, y los datos brutos de MS son procesados por el algoritmo MaxQuant para la identificación de péptidos R-metilo. Finalmente, los resultados de salida de MaxQuant se procesan con hmSEEKER, una herramienta bioinformática desarrollada internamente para buscar pares de péptidos metilo pesados y ligeros. Brevemente, hmSEEKER lee y filtra las identificaciones de péptidos metilo del archivo msms, luego compara cada péptido metilo con su pico MS1 correspondiente en el archivo allPeptides y, finalmente, busca el pico de la contraparte del péptido pesado / ligero. Para cada par pesado-ligero putativo, se calculan los parámetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) y Mass Error (ME), y los dobletes que se encuentran dentro de los puntos de corte definidos por el usuario se etiquetan como verdaderos positivos. El flujo de trabajo del protocolo bioquímico se describe en la Figura 1.
La identificación de alta confianza de la metilación in vivo de proteínas/péptidos mediante proteómica global basada en EM es un desafío, debido al riesgo de FDR alta, con varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación que ocurren durante la preparación de la muestra que son isobáricas a la metilación y pueden causar asignaciones incorrectas en ausencia de estrategias ortogonales de validación de EM. La naturaleza subestequiométrica de este PTM complica aún más la tarea de la metilprote…
The authors have nothing to disclose.
MM y EM son estudiantes de doctorado dentro de la Escuela Europea de Medicina Molecular (SEMM). EM recibe una beca FIRC-AIRC de 3 años (Código del proyecto: 22506). Los análisis globales de R-metil-proteomas en el grupo de TB están respaldados por la subvención AIRC IG (Código del proyecto: 21834).
Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |