基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质R-甲基化分析

精氨酸（R）-甲基化是一种翻译后修饰（PTM），可装饰约1%的哺乳动物蛋白质组¹。蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是通过一个或两个甲基以对称或不对称方式沉积到R侧链胍基的氮（N）原子上来催化R-甲基化反应的酶。在哺乳动物中，PRMT可分为三类 – I型，II型和III型 – 取决于它们沉积单甲基化（MMA）和不对称二甲基化（ADMA），MMA和对称二甲基化（SDMA）或仅MMA的能力，分别2^，3。PRMT主要靶向位于富含甘氨酸和精氨酸的区域的R残基，称为GAR基序，但一些PRMTs，如PRMT5和CARM1，可以将脯氨酸-甘氨酸-富含蛋氨酸（PGM）基序^4甲基化。R-甲基化已成为几种生物过程的蛋白质调节剂，例如RNA剪接⁵，DNA修复⁶，miRNA生物发生⁷和翻译²，促进了对该PTM的研究。

质谱 （MS） 被认为是以蛋白质、肽和位点分辨率系统研究全局 R-甲基化的最有效技术。但是，该PTM需要一些特殊的预防措施才能通过MS进行高置信度鉴定。首先，R-甲基化是亚化学计量的，肽的未修饰形式比修饰的肽丰富得多，因此在数据依赖性采集（DDA）模式下运行的质谱仪将比低强度甲基化对应物更频繁地破碎高强度未修饰^肽8。此外，大多数用于R-甲基化位点鉴定的基于MS的工作流程在生物信息学分析水平上存在局限性。事实上，甲基肽的计算鉴定容易产生高错误发现率（FDR），因为这种PTM与各种氨基酸取代（例如，甘氨酸转化为丙氨酸）和化学修饰（例如天冬氨酸和谷氨酸的甲酯化）同量异^位9。因此，基于甲基同位素标记的方法，例如细胞培养中氨基酸重甲基稳定同位素标记（hmSILAC），已被实施为正交策略，用于 体内甲基化的 可靠MS鉴定，显着降低了假阳性注释的发生率¹⁰。

最近，研究R-甲基化蛋白质的各种蛋白质组范围方案已经优化。基于抗体的R-甲基肽免疫亲和富集策略的开发导致了人类细胞中数百个R-甲基化位点的注释^11，12。此外，许多研究³，¹³报告说^，将基于抗体的富集与肽分离技术（如HpH-RP色谱分级分离）偶联可以增加鉴定的甲基肽总数。

本文介绍了一种基于各种生化和分析步骤的系统、高置信度鉴定人细胞中 R-甲基化位点的实验策略：从 hmSILAC 标记的细胞中提取蛋白质，使用胰蛋白酶和 LysargiNase 蛋白酶进行平行双酶消化，然后对消化肽进行 HpH-RP 色谱分级分离，再加上基于抗体的 MMA-、SDMA-、 和含ADMA的肽。然后，在DDA模式下通过高分辨率液相色谱（LC）-MS/MS对所有亲和富集肽进行分析，并使用MaxQuant算法处理原始MS数据以鉴定R-甲基肽。最后，使用hmSEEKER处理MaxQuant输出结果，hmSEEKER是一种内部开发的生物信息学工具，用于搜索重质和轻质甲基肽对。简而言之，hmSEEKER从msms文件中读取并过滤甲基肽鉴定，然后将每个甲基肽与其在allPeptides文件中相应的MS1峰相匹配，最后搜索重肽/轻肽对应物的峰。对于每个假定的重光对，计算Log2 H/L比（LogRatio）、保留时间差（dRT）和质量误差（ME）参数，并将位于用户定义的截止值内的双峰标记为真阳性。生化方案的工作流程如图 1所示。