Özet

نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل مثيلة البروتين R العالمية وعالية الثقة

Published: April 28, 2022
doi:

Özet

بروتين أرجينين (R) – مثيلة هو تعديل واسع الانتشار بعد الترجمة ينظم مسارات بيولوجية متعددة. يعد قياس الطيف الكتلي أفضل تقنية لتحديد ملامح R-methyl-proteome عالميا ، عندما يقترن بالنهج الكيميائية الحيوية لتخصيب الببتيد المعدل. يتم وصف سير العمل المصمم لتحديد الثقة العالية لمثيلة R العالمية في الخلايا البشرية هنا.

Abstract

بروتين أرجينين (R) – مثيلة هو بروتين واسع الانتشار بعد التعديل الانتقالي (PTM) يشارك في تنظيم العديد من المسارات الخلوية ، بما في ذلك معالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة ، والاستجابة لتلف الحمض النووي ، والتولد الحيوي للحمض النووي الريبي ، والترجمة.

في السنوات الأخيرة ، وبفضل التطورات البيوكيميائية والتحليلية ، برزت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) باعتبارها الاستراتيجية الأكثر فعالية لتوصيف بروتينات الميثيل الخلوية بدقة موقع واحد. ومع ذلك ، فإن تحديد وتنميط مثيلة البروتين الحي R-methylation بواسطة MS لا يزال يمثل تحديا وعرضة للخطأ ، ويرجع ذلك أساسا إلى الطبيعة التكميلية لهذا التعديل ووجود بدائل مختلفة للأحماض الأمينية وأسترة الميثيل الكيميائية للمخلفات الحمضية التي تكون متساوية الضغط للمثيلة. ومن ثم، يلزم اتباع أساليب إثراء لتعزيز تحديد ببتيدات R-methyl واستراتيجيات التحقق المتعامدة للحد من معدلات الاكتشاف الخاطئ في دراسات بروتينات الميثيل.

هنا ، يتم وصف بروتوكول مصمم خصيصا لتحديد ببتيدات R-methyl عالية الثقة وكميتها من العينات الخلوية ، والذي يجمع بين وضع العلامات الأيضية للخلايا مع الميثيونين المشفر بالنظائر الثقيلة (hmSILAC) وهضم البروتياز المزدوج في المحلول لمستخلص الخلية الكاملة ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا المرحلة المعكوسة عالية الأس الهيدروجيني (HpH-RP) خارج الخط وإثراء تقارب R-methyl-peptides باستخدام الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl. عند تحليل MS عالي الدقة ، تتم معالجة البيانات الأولية أولا باستخدام حزمة برامج MaxQuant ثم يتم تحليل النتائج بواسطة hmSEEKER ، وهو برنامج مصمم للبحث المتعمق لأزواج ذروة MS المقابلة لببتيد الميثيل الخفيف والثقيل داخل ملفات إخراج MaxQuant.

Introduction

أرجينين (R) – مثيلة هو تعديل ما بعد الترجمة (PTM) الذي يزين حوالي 1 ٪ من البروتينالثديي 1. بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) هي الإنزيمات التي تحفز تفاعل R-methylation عن طريق ترسب مجموعة أو مجموعتين من الميثيل إلى ذرات النيتروجين (N) لمجموعة guanidino من السلسلة الجانبية ل R بطريقة متماثلة أو غير متماثلة. في الثدييات ، يمكن تجميع PRMTs في ثلاث فئات – النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث – اعتمادا على قدرتها على إيداع كل من المثيلة الأحادية (MMA) وثنائي المثيلة غير المتماثل (ADMA) و MMA وثنائي المثيلة المتماثل (SDMA) أو MMA فقط ،على التوالي 2,3. تستهدف PRMTs بشكل أساسي بقايا R الموجودة داخل المناطق الغنية بالجليكاين والأرجينين ، والمعروفة باسم زخارف GAR ، ولكن بعض PRMTs ، مثل PRMT5 و CARM1 ، يمكن أن تكون ميثيل البرولين – الجلايسين – الزخارف الغنية بالميثيونين (PGM)4. برز R-methylation كمغير بروتين للعديد من العمليات البيولوجية ، مثل ربط الحمض النوويالريبي 5 ، وإصلاح الحمض النووي6 ، والتولد الحيويmiRNA 7 ، والترجمة2 ، مما يعزز البحث في PTM هذا.

يعرف قياس الطيف الكتلي (MS) بأنه أكثر التقنيات فعالية لدراسة مثيلة R العالمية بشكل منهجي بدقة البروتين والببتيد والموقع. ومع ذلك ، يتطلب PTM هذا بعض الاحتياطات الخاصة لتحديد الثقة العالية من قبل MS. أولا ، R-methylation هو قياس ، حيث يكون الشكل غير المعدل للببتيدات أكثر وفرة من الببتيدات المعدلة ، بحيث تقوم مطياف الكتلة التي تعمل في وضع اكتساب البيانات (DDA) بتجزئة الببتيدات غير المعدلة عالية الكثافة في كثير من الأحيان أكثر من نظيراتها الميثيلية منخفضة الكثافة8. علاوة على ذلك ، فإن معظم تدفقات العمل المستندة إلى MS لتحديد موقع R-methylated تعاني من قيود على مستوى التحليل المعلوماتي الحيوي. في الواقع ، فإن التحديد الحسابي لببتيدات الميثيل عرضة لمعدلات اكتشاف خاطئة عالية (FDR) ، لأن PTM هذا متساوي الضغط لبدائل الأحماض الأمينية المختلفة (على سبيل المثال ، الجلايسين في ألانين) والتعديل الكيميائي ، مثل أسترة الميثيل للأسبارتات والغلوتامات9. ومن ثم ، فقد تم تنفيذ طرق تستند إلى توسيم النظائر لمجموعات الميثيل ، مثل وضع العلامات على النظائر المستقرة للميثيل الثقيل مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (hmSILAC) ، كاستراتيجيات متعامدة لتحديد MS الواثق للمثيلات في الجسم الحي ، مما يقلل بشكل كبير من معدل التعليقات التوضيحية الإيجابية الخاطئة10.

في الآونة الأخيرة ، تم تحسين بروتوكولات مختلفة على مستوى البروتين لدراسة البروتينات R-methylated. أدى تطوير الاستراتيجيات القائمة على الأجسام المضادة لإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl-peptides إلى شرح عدة مئات من مواقع R-methylated في الخلايا البشرية11,12. علاوة على ذلك ، ذكرت العديد من الدراسات 3,13 أن اقتران الإثراء القائم على الأجسام المضادة بتقنيات فصل الببتيد مثل تجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP يمكن أن يعزز العدد الإجمالي لببتيدات الميثيل المحددة.

تصف هذه المقالة استراتيجية تجريبية مصممة لتحديد منهجي وعالي الثقة لمواقع R-methylated في الخلايا البشرية ، بناء على خطوات كيميائية حيوية وتحليلية مختلفة: استخراج البروتين من الخلايا التي تحمل علامة hmSILAC ، والهضم الأنزيمي المزدوج المتوازي مع بروتياز التربسين و LysargiNase ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافية HpH-RP للببتيدات المهضومة ، إلى جانب إثراء التقارب المناعي القائم على الأجسام المضادة ل MMA- ، SDMA- ، والببتيدات المحتوية على ADMA. ثم يتم تحليل جميع الببتيدات المخصبة بالتقارب بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الدقة (LC) -MS / MS في وضع DDA ، وتتم معالجة بيانات MS الخام بواسطة خوارزمية MaxQuant لتحديد R-methyl-peptides. أخيرا ، تتم معالجة نتائج إخراج MaxQuant باستخدام hmSEEKER ، وهي أداة معلوماتية حيوية مطورة داخليا للبحث عن أزواج من ببتيدات الميثيل الثقيلة والخفيفة. باختصار ، يقرأ hmSEEKER ويصفي تعريفات ببتيدات الميثيل من ملف msms ، ثم يطابق كل ببتيد ميثيل مع ذروة MS1 المقابلة له في ملف جميع الببتيدات ، وأخيرا ، يبحث في ذروة نظيره الببتيد الثقيل / الخفيف. لكل زوج من أزواج الضوء الثقيل المفترضة ، يتم حساب نسبة Log2 H / L (LogRatio) وفرق وقت الاحتفاظ (dRT) ومعلمات خطأ الكتلة (ME) ، ويتم تصنيف الثنائيات الموجودة داخل عمليات القطع المحددة من قبل المستخدم على أنها إيجابيات حقيقية. يتم وصف سير عمل البروتوكول الكيميائي الحيوي في الشكل 1.

Protocol

1. زراعة الخلايا واستخراج البروتين (الوقت: 3 – 4 أسابيع مطلوبة) تنمو خلايا هيلا بالتوازي في وسط مزود إما بالميثيونين الخفيف (L) أو الثقيل (H) ، على التوالي (انظر الجدول 1 لتكوين الوسائط). عند ثمانية انقسامات خلوية على الأقل ، اجمع حصة من الخلايا من كل قناة SILAC وقم بإجراء اختبار الدمج….

Representative Results

تصف المقالة سير العمل لتحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين العالمي R-methylation ، والذي يعتمد على مزيج من الهضم الأنزيمي لمستخلص البروتين مع اثنين من البروتياز المتميزين بالتوازي ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة للببتيدات المحللة للبروتين وإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl مع ا?…

Discussion

يمثل تحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين / الببتيد في الجسم الحي بواسطة البروتينات العالمية القائمة على مرض التصلب العصبي المتعدد أمرا صعبا ، بسبب خطر ارتفاع FDR ، مع حدوث العديد من بدائل الأحماض الأمينية وأسترة الميثيل أثناء تحضير العينة التي تكون متساوية الضغط للمثيلة ويمكن أن تسبب…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MM و EM هم طلاب دكتوراه في المدرسة الأوروبية للطب الجزيئي (SEMM). EM هو المستفيد من منحة FIRC-AIRC لمدة 3 سنوات (رمز المشروع: 22506). يتم دعم التحليلات العالمية لبروتينات R-methyl-في مجموعة السل من قبل AIRC IG Grant (رمز المشروع: 21834).

Materials

Ammonium Bicarbonate (AMBIC) Sigma-Aldrich 09830
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich 497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) Waters WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant Sigma-Aldrich ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free Roche-Sigma Aldrich 11836170001 Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO ThermoFisher 26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 3483-12-3
DMEM Medium GIBCO ThermoFisher requested  with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns ThermoFisher ES907
Glycerolo Sigma-Aldrich G5516
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich 144-48-9
Jupiter C12-RP column Phenomenex 00G-4396-E0
L-Methionine Sigma-Aldrich M5308 Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3) Sigma-Aldrich 299154 Heavy (H) Methionine
LysargiNase Merck Millipore EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Penicillin-Streptomycin GIBCO ThermoFisher 15140122
PhosSTOP Roche-Sigma Aldrich 4906837001 Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips ThermoFisher 87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade ThermoFisher 85175 LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade ThermoFisher 85170 LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade ThermoFisher 51101
Pierce  Water, LC-MS Grade ThermoFisher 51140
Polyacrylamide Sigma-Aldrich 92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610373
PTMScan antibodies α-ADMA Cell Signaling Technology 13474
PTMScan antibodies α-MMA Cell Signaling Technology 12235
PTMScan antibodies α-SDMA Cell Signaling Technology 13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5113
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Urea Sigma-Aldrich U5378
Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Speed vac

Referanslar

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis. J. Vis. Exp. (182), e62409, doi:10.3791/62409 (2022).

View Video