Özet

Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности

Published: April 28, 2022
doi:

Özet

Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией, регулирующей несколько биологических путей. Масс-спектрометрия является лучшей технологией для глобального профилирования R-метил-протеома в сочетании с биохимическими подходами к обогащению модифицированными пептидами. Рабочий процесс, предназначенный для высокой достоверности идентификации глобального R-метилирования в клетках человека, описан здесь.

Abstract

Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.

В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.

Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.

Introduction

Аргинин (R)-метилирование представляет собой посттрансляционную модификацию (PTM), которая украшает около 1% протеома млекопитающих1. Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) представляют собой ферменты, катализирующие реакцию R-метилирования путем осаждения одной или двух метильных групп к атомам азота (N) группы гуанидино боковой цепи R симметричным или асимметричным образом. У млекопитающих PRMT могут быть сгруппированы в три класса – тип I, тип II и тип III – в зависимости от их способности депонировать как монометилирование (ММА), так и асимметричное диметилирование (ADMA), ММА и симметричное диметилирование (SDMA) или только ММА, соответственно 2,3. PRMT в основном нацелены на остатки R, расположенные в богатых глицином и аргинином регионах, известных как мотивы GAR, но некоторые PRMT, такие как PRMT5 и CARM1, могут метилировать пролин-глицин-метионин-богатые (PGM) мотивы4. R-метилирование появилось как модулятор белка нескольких биологических процессов, таких как сплайсинг РНК5, репарация ДНК6, биогенез миРНК7 и трансляция2, способствуя исследованиям этого ПТМ.

Масс-спектрометрия (МС) признана наиболее эффективной технологией для систематического изучения глобального R-метилирования при разрешении белка, пептида и сайта. Тем не менее, этот PTM требует некоторых особых мер предосторожности для его высокой достоверности идентификации по РС. Во-первых, R-метилирование является субстохиометрическим, причем немодифицированная форма пептидов гораздо более распространена, чем модифицированные, так что масс-спектрометры, работающие в режиме Data Dependent Acquisition (DDA), будут фрагментировать высокоинтенсивные немодифицированные пептиды чаще, чем их метилированные аналоги с более низкой интенсивностью8. Кроме того, большинство рабочих процессов на основе МС для идентификации R-метилированных участков страдают от ограничений на уровне биоинформационного анализа. Действительно, вычислительная идентификация метилпептидов подвержена высоким показателям ложного открытия (FDR), потому что этот PTM является изобарическим для различных аминокислотных замен (например, глицин в аланин) и химической модификации, такой как метилэтерификация аспартата и глутамата9. Следовательно, методы, основанные на изотопной маркировке метильных групп, такие как Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), были реализованы в качестве ортогональных стратегий для уверенной MS-идентификации метилирования in vivo , значительно снижая частоту ложноположительных аннотаций10.

В последнее время были оптимизированы различные протоколы для изучения R-метилированных белков. Разработка основанных на антителах стратегий иммуноаффинного обогащения R-метилпептидов привела к аннотированию нескольких сотен R-метилированных участков в клетках человека11,12. Кроме того, во многих исследованиях 3,13 сообщалось, что соединение обогащения на основе антител с методами разделения пептидов, такими как фракционирование хроматографии HpH-RP, может увеличить общее количество идентифицированных метилпептидов.

В данной статье описывается экспериментальная стратегия, предназначенная для систематической и высокодостоверной идентификации R-метилированных участков в клетках человека, основанная на различных биохимических и аналитических этапах: экстракция белка из клеток, меченых hmSILAC, параллельное двойное ферментативное пищеварение протеазами трипсина и лисаргиназы с последующим хроматографическим фракционированием HpH-RP переваренных пептидов в сочетании с иммуноаффинным обогащением на основе антител MMA-, SDMA-, и ADMA-содержащие пептиды. Все обогащенные аффинностью пептиды затем анализируются методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (LC)-MS/MS в режиме DDA, а необработанные данные MS обрабатываются алгоритмом MaxQuant для идентификации R-метилпептидов. Наконец, выходные результаты MaxQuant обрабатываются с помощью hmSEEKER, собственного инструмента биоинформатики для поиска пар тяжелых и легких метилпептидов. Вкратце, hmSEEKER считывает и фильтрует идентификацию метилпептидов из файла msms, затем сопоставляет каждый метилпептид с соответствующим пиком MS1 в файле allPeptides и, наконец, ищет пик тяжелого/ легкого пептидного аналога. Для каждой предполагаемой пары тяжелых легких вычисляются коэффициент Log2 H/L (LogRatio), разность времени удержания (dRT) и параметры mass error (ME), а дублеты, расположенные в пределах заданных пользователем отсечек, помечаются как истинные положительные значения. Рабочий процесс биохимического протокола описан на рисунке 1.

Protocol

1. Культивирование клеток и экстракция белка (требуется время: 3 – 4 недели) Выращивайте клетки HeLa параллельно в средах, снабженных либо легким (L), либо тяжелым (H) метионином соответственно (см. Таблицу 1 для композиции среды). По крайней мере, после восьми делений клеток собер?…

Representative Results

В статье описан рабочий процесс для высокодоверной идентификации глобального R-метилирования белка, который основан на сочетании ферментативного переваривания белкового экстракта с двумя различными протеазами параллельно, с последующим фракционированием жидкой хроматографии HpH-RP п…

Discussion

Высоконадежная идентификация метилирования белка/пептида in vivo глобальной протеомикой на основе РС является сложной задачей из-за риска высокого FDR, с несколькими аминокислотными замещениями и метилэтерификацией, происходящими во время подготовки образца, которые являются изоба…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MM и EM являются аспирантами Европейской школы молекулярной медицины (SEMM). EM является получателем 3-летней стипендии FIRC-AIRC (Код проекта: 22506). Глобальные анализы R-метил-протеомов в группе туберкулеза поддерживаются грантом AIRC IG (Код проекта: 21834).

Materials

Ammonium Bicarbonate (AMBIC) Sigma-Aldrich 09830
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich 497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) Waters WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant Sigma-Aldrich ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free Roche-Sigma Aldrich 11836170001 Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO ThermoFisher 26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 3483-12-3
DMEM Medium GIBCO ThermoFisher requested  with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns ThermoFisher ES907
Glycerolo Sigma-Aldrich G5516
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich 144-48-9
Jupiter C12-RP column Phenomenex 00G-4396-E0
L-Methionine Sigma-Aldrich M5308 Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3) Sigma-Aldrich 299154 Heavy (H) Methionine
LysargiNase Merck Millipore EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Penicillin-Streptomycin GIBCO ThermoFisher 15140122
PhosSTOP Roche-Sigma Aldrich 4906837001 Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips ThermoFisher 87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade ThermoFisher 85175 LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade ThermoFisher 85170 LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade ThermoFisher 51101
Pierce  Water, LC-MS Grade ThermoFisher 51140
Polyacrylamide Sigma-Aldrich 92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610373
PTMScan antibodies α-ADMA Cell Signaling Technology 13474
PTMScan antibodies α-MMA Cell Signaling Technology 12235
PTMScan antibodies α-SDMA Cell Signaling Technology 13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5113
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Urea Sigma-Aldrich U5378
Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Speed vac

Referanslar

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis. J. Vis. Exp. (182), e62409, doi:10.3791/62409 (2022).

View Video