Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

L’arginina (R)-metilazione è una modificazione post-traduzionale (PTM) che decora circa l’1% del proteoma 1 dei^mammiferi. Le proteine arginina metiltransferasi (PRMT) sono gli enzimi che catalizzano la reazione di R-metilazione mediante la deposizione di uno o due gruppi metilici agli atomi di azoto (N) del gruppo guanidino della catena laterale di R in modo simmetrico o asimmetrico. Nei mammiferi, i PRMT possono essere raggruppati in tre classi – tipo I, tipo II e tipo III – a seconda della loro capacità di depositare sia la monometilazione (MMA) che la dimetilazione asimmetrica (ADMA), l’MMA e la dimetilazione simmetrica (SDMA) o solo MMA, rispettivamente ^2,3. I PRMT colpiscono principalmente i residui di R situati all’interno di regioni ricche di glicina e arginina, noti come motivi GAR, ma alcuni PRMT, come PRMT5 e CARM1, possono metilare motivi ricchi di prolina-glicina-metionina (PGM)⁴. La R-metilazione è emersa come modulatore proteico di diversi processi biologici, come lo splicing dell’RNA⁵, la riparazione del DNA⁶, la biogenesi^{7 dei} miRNA e la traduzione², promuovendo la ricerca su questo PTM.

La spettrometria di massa (MS) è riconosciuta come la tecnologia più efficace per studiare sistematicamente la R-metilazione globale a risoluzione di proteine, peptidi e siti. Tuttavia, questo PTM richiede alcune precauzioni particolari per la sua identificazione ad alta affidabilità da parte della SM. In primo luogo, la R-metilazione è substechiometrica, con la forma non modificata dei peptidi che è molto più abbondante di quelli modificati, in modo che gli spettrometri di massa che operano in modalità Data Dependent Acquisition (DDA) frammentano peptidi non modificati ad alta intensità più spesso delle loro controparti metilate a bassa intensità⁸. Inoltre, la maggior parte dei flussi di lavoro basati su MS per l’identificazione del sito R-metilato soffrono di limitazioni a livello di analisi bioinformatica. In effetti, l’identificazione computazionale dei peptidi metilici è soggetta ad alti tassi di falsa scoperta (FDR), perché questo PTM è isobarico a varie sostituzioni aminoacidiche (ad esempio, glicina in alanina) e modificazioni chimiche, come la metil-esterificazione dell’aspartato e del glutammato⁹. Pertanto, metodi basati sulla marcatura isotopica di gruppi metilici, come l’Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), sono stati implementati come strategie ortogonali per l’identificazione sicura della MS di metilazioni in vivo , riducendo significativamente il tasso di annotazioni false positive¹⁰.

Recentemente, sono stati ottimizzati vari protocolli a livello di proteoma per studiare le proteine R-metilate. Lo sviluppo di strategie basate su anticorpi per l’arricchimento di immuno-affinità di R-metil-peptidi ha portato all’annotazione di diverse centinaia di siti R-metilati in cellule umane^11,12. Inoltre, molti studi ^3,13 hanno riportato che l’accoppiamento dell’arricchimento basato su anticorpi con tecniche di separazione peptidica come il frazionamento cromatografico HpH-RP può aumentare il numero complessivo di peptidi metilici identificati.

Questo articolo descrive una strategia sperimentale progettata per l’identificazione sistematica e ad alta affidabilità di siti R-metilati in cellule umane, basata su varie fasi biochimiche e analitiche: estrazione di proteine da cellule marcate con hmSILAC, digestione enzimatica doppia parallela con proteasi Tripsina e LysargiNase, seguita da frazionamento cromatografico HpH-RP di peptidi digeriti, accoppiato con arricchimento di immuno-affinità basato su anticorpi di MMA-, SDMA-, e peptidi contenenti ADMA. Tutti i peptidi arricchiti di affinità vengono quindi analizzati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (LC)-MS/MS in modalità DDA e i dati grezzi MS vengono elaborati dall’algoritmo MaxQuant per l’identificazione dei peptidi R-metilici. Infine, i risultati dell’output di MaxQuant vengono elaborati con hmSEEKER, uno strumento bioinformatico sviluppato internamente per cercare coppie di peptidi metilici pesanti e leggeri. In breve, hmSEEKER legge e filtra le identificazioni dei peptidi metilici dal file msms, quindi abbina ciascun peptide metilico al suo picco MS1 corrispondente nel file allPeptides e, infine, cerca il picco della controparte peptidica pesante / leggera. Per ogni coppia putativa pesante-leggera, vengono calcolati i parametri Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) e i doppietti che si trovano all’interno di cut-off definiti dall’utente vengono etichettati come veri positivi. Il flusso di lavoro del protocollo biochimico è descritto nella Figura 1.