Изотахофореза (ИТП) является надежным электрокинетического разделения и концентрирования техники с приложениями от токсинов обнаружения пробоподготовки. Мы рассматриваем физические принципы ИТП и методологию применения этого метода на два конкретных приложений например: разделения и обнаружения малых молекул и очистки нуклеиновых кислот из Клеточный лизат культуры.
Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the “ITP interface”). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: “peak” and “plateau” modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.
ИТП методы, представленные здесь, позволяют быстро, чувствительный и надежный обнаружения и обработки ионных молекул. Основной проблемой при использовании ИТП является правильный выбор LE и TE буфера. В ИТП анионные, мы обычно выбирают хлорида в качестве ведущей анионов, потому что это сильная кислота с высокой абсолютной мобильности и, следовательно, имеет очень прогнозируемыми свойствами. Таким образом, выбор буфера в анионной ИТП, как правило, сводится к выбору надлежащего TE и противоионов. Для селективного фокусировки экспериментов, Т. выбор имеет решающее значение для исключения загрязнения ионами. В случаях, когда загрязнения нет, ниже TE эффективной мобильности приводит к ускорению скорости фокусировки. Мы рекомендуем использовать следующие, относительно хорошо себя анионный TE ионов: МЧС, MOPS, HEPES, tricine. Выбор противоиона влияет как на рН системы и TE эффективной мобильности. Общие противоионов являются трис (рКа 8,1) и бис-трис (рКа 6,4). Для анализов требуется выше или ниже рН, мы рекомендуем пиридина (рКа 5,25) иэтаноламина (рКа 9,5), соответственно. В таблицах 1 и 2, для анионных и катионных ИТП, соответственно, мы суммируем несколько полезных примеров буфера. Мы HCl как анионные ION LE и натрия в качестве катионного LE ионов, и мы предполагаем, 100 мМ ионной силы буфера LE.
Читатель заметит, что сила ионного буфера в наших протоколов (и в таблицах 1-2) всегда больше или равно 10 мм. Хотя в теории физики ИТФ применяется в ионной силы ниже, чем 10 мм, природные загрязнители (например, углекислоты от реакции между водой и углекислого газа в атмосфере) около 1 мм уровне часто ограничивают практическое использование низкой ионной силы.
Отметим, что механизм передачи сигнала не ограничивается анализы, представленные в этом протоколе. Как уже говорилось вкратце в части 5, в режиме плато очищенной зоны могут быть обнаружены с помощью изменений в локальной проводимости, УФ absorbance, температуры или показателя преломления. В нашей группе, мы разработали метод, который использует флуоресцентные амфолитов носитель для чувствительного обнаружения и идентификации неизвестных аналитов. 5 В пик экспериментов режиме зондами могут быть использованы для обозначения сосредоточены аналитов. В одном примере, мы используем молекулярную маяки – олигонуклеотидных зондов, которые светятся при гибридизации их последовательности-мишени – для выявления ДНК мишени или молекулы РНК с высокой специфичностью 11,18.
Хотя ITP является относительно устойчивым к дисперсии в результате давления управляемых потоков и EOF, чрезмерное EOF может привести к стагнации интерфейс ITP, где средняя скорость EOF становится равной скорости ИТП 14. Такие сильные обрыв особенно в условиях высоких значениях рН и низкой ионной силы. По этой причине, мы рекомендуем использовать буфер с рН 8 или ниже, и с ионной силой порядка 100 мм, если удобно. По нашему опыту, ПВПНаиболее эффективным покрытием для подавления EOF в боросиликатного чипов. Однако, поскольку его просеивание свойства, ПВП, может не подходить для некоторых приложений, таких как фокусировка геномной ДНК. В экспериментах, заметим, что добавление ПВП может значительно снизить геномной ДНК абсолютной мобильности (до точки, где это не фокус). В этих случаях силанольных покрытия, такие как Sigmacote в связке с поверхностно-активных веществ (например, тритон X-100) также могут быть эффективными в снижении EOF 10.
TE анион (рКа 1) | ||||
Буферизация противоиона (рКа +1) | MES (6.10) | MOPS (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
этаноламина (9.50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
трис (8,08) | 21,00 | 19,23 </ TD> | 15,84 | 17,56 |
бис-трис (6.40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
пиридина (5.18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Таблица 1. Эффективная величина подвижности (× 10 -9 м 2 / В / с), скорректированной чистой зоне аналита в анионной ИТП, где LE составляет 100 мм HCl и 200 мм буферизации противоионов.
TE катионов (рКа +1) | ||||
Буферизация противоиона (рКа 1) | этаноламина (9.50) | трис (8,08) | бис-трис (6.40) | пиридина (5.18) |
MES (6.10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
МиссуриPS (7.20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7.50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricine (8.15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Таблица 2. Эффективная величина подвижности (× 10 -9 м 2 / В / с), скорректированной чистой зоне аналита в катионной ИТП, где LE 100 натрия мм и 200 мм буферизации противоионов.
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем глубокую признательность финансирование DARPA спонсируемых Micro / Nano Fluidics Основы Focus (MF3) Центр по контракту номер N66001-10-1-4003, и от DARPA грант N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.