Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados de cultura de células.
Técnicas de eletrocinética são um grampo de aplicações em microescala devido à sua capacidade única de realizar uma variedade de processos fluídicos e eletroforética em simples, sistemas compactos, sem partes móveis. Isotachophoresis (ITP) é uma técnica simples e muito robusta eletrocinético que pode conseguir a separação milhão de vezes pré-concentração 1,2 e eficiente e extracção com base na mobilidade iónica. 3 Por exemplo, demonstramos a aplicação de ITP para separação e detecção sensível de não marcado moléculas iónicas (toxinas, por exemplo, ADN, rRNA, miRNA) com pouca ou nenhuma amostra preparação 4-8 e para a extracção e purificação de ácidos nucleicos a partir de matrizes complexas, incluindo cultura de células, urina e sangue. 9-12
ITP alcança de focagem e de separação utilizando um campo eléctrico aplicado e dois tampões dentro de um sistema de canal fluídica. Para analitos aniónicos, o líder de electrólito tampão (LE) é escolhido such que os seus aniões têm maior mobilidade electroforética eficaz do que os aniões do electrólito à direita (TE) tampão (mobilidade eficaz descreve a velocidade de deriva observável de um ião e leva em conta o estado de ionização da iónica, como descrito em detalhe por Persat et al . 13). Depois de estabelecer uma interface entre o TE e LE, um campo eléctrico é aplicado de tal forma que os iões LE afastar-se da região ocupada por iões TE. Íons de exemplo de raça mobilidade intermediária eficaz à frente de íons TE, mas não pode ultrapassar os íons LE, e assim eles se concentram na interface LE-TE (doravante denominado o "interface ITP"). Além disso, o TE e regiões de formulário LE de condutividade de baixa e alta, respectivamente, que permitem estabelecer uma gradiente de campo eléctrico íngreme na interface ITP. Este gradiente de campo pré-concentrados espécie de amostra como eles se concentram. A escolha adequada de TE e LE resulta em foco e purificação de espécies alvo a partir de outras espécies não-focadas e, eventualmente, uma separaçãosegregação d de espécies de amostra.
Nós aqui rever o ITP princípios físicos subjacentes e discutir dois modos padrão de operação: "pico" e "plateau" modos. No modo de pico, relativamente diluir os íons da amostra foco em conjunto dentro de sobreposição de picos estreitos na interface ITP. No modo de planalto, os íons mais abundantes da amostra atingir uma concentração de estado estacionário e segregar em-planalto adjacentes como zonas ordenadas por sua mobilidade eficaz. Modos de pico e de platô surgir da mesma física subjacente, mas representam os regimes distintos diferenciadas pela concentração de analito inicial e / ou a quantidade de tempo disponível para a acumulação de amostra.
Nós primeiro descrever em detalhe um modelo experimental modo pico e, então, demonstrar um ensaio de modo pico para a extracção de ácidos nucleicos a partir de E. de cultura de células E. coli. Nós concluímos apresentando um ensaio de modo planalto, onde usamos um não-centrados Tracer (NFT) espécies para visualizar a separação e porformar quantificação de aminoácidos.
Os métodos aqui apresentados ITP permitir a detecção rápida, sensível e robusto e manipulação de moléculas iónicas. O principal desafio em utilizar ITP é uma escolha adequada dos buffers LE e TE. Em ITP aniónico, que tipicamente escolher cloreto como anião líder porque é um ácido forte com muito elevada mobilidade absoluta e, portanto, tem propriedades muito previsíveis. Portanto, a escolha de buffer no aniônico ITP é normalmente reduzido a escolha de um TE adequado e contra-. Para experimentos seletivos com foco, escolha TE é fundamental para a exclusão de contaminação de íons. Em aplicações onde os contaminantes não estão presentes, menor mobilidade TE eficaz conduz a taxa mais rápida de focagem. Recomendamos utilizar o seguinte, relativamente bem-comportado íons aniônicos TE: MES, MOPS, HEPES, TRICINA. Escolha de contra-afeta tanto o pH do sistema e TE mobilidade eficaz. Contraiões comuns são tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Para os ensaios que requerem pH inferior ou superior, é recomendável piridina (pKa 5,25) eetanolamina (pKa 9,5), respectivamente. Nas Tabelas 1 e 2, para ITP aniónico e catiónico, respectivamente, resumem-se vários exemplos tampão úteis. Tomamos HCl como o íon LE aniônicos e catiônicos de sódio como LE ion, e assumimos 100 mM força iónica do tampão LE.
O leitor notará que a força iónica tampão nos nossos protocolos (e nas Tabelas 1-2) é sempre maior do que ou igual a 10 mM. Embora, em teoria, a física de ITP aplica-se a força iónica inferior a 10 mM, contaminantes naturais (por exemplo, ácido carbónico a partir da reacção entre água e dióxido de carbono atmosférico) perto do nível 1 mM, muitas vezes limita o uso prático de baixa força iónica buffers.
Fazemos notar que o mecanismo de transdução de sinal não está limitada aos ensaios apresentados neste protocolo. Como discutido brevemente na parte 5, no modo de planalto purificado zonas podem ser detectados através de alterações na condutividade local, unidade de absorvância UVBance, temperatura, índice ou de refração. No nosso próprio grupo, desenvolvemos um método que utiliza anfólitos transportadora fluorescentes para uma detecção sensível e identificação de analitos desconhecidos. 5 Em experiências modo de pico, sondas específicas pode ser utilizada para rotular analitos focadas. Em um exemplo, nós usamos beacons moleculares – sondas de oligonucleotídeos que apresentam fluorescência em hibridação em sua seqüência alvo – para detectar DNA alvo ou moléculas de RNA com alta especificidade 11,18.
Enquanto ITP é relativamente robusta para dispersão causada pela pressão do fluxo orientado e EOF, EOF excessivo pode levar a estagnação da interface ITP, onde a velocidade EOF média torna-se igual à velocidade ITP. 14 EOF Tal forte ocorre especialmente em condições de pH elevado e baixa força iônica. Por esta razão, recomenda-se o uso de tampões com pH 8 ou mais baixo e com força iónica na ordem de 100 mm, se conveniente. Em nossa experiência, é o PVPrevestimento mais eficaz para a supressão de EOF em fichas de borosilicato. No entanto, devido às suas propriedades de peneiração, PVP pode não ser adequado para algumas aplicações, tais como focagem ADN genómico. Em experiências, observa-se que a adição de PVP pode reduzir grandemente a mobilidade de DNA genómico absoluto (até ao ponto em que não se concentrar). Nestes casos um revestimento silanol tal como Sigmacote em conjunto com um agente tensioactivo (por exemplo, Triton-X 100) pode também ser eficaz na redução EOF. 10
TE anião (pKa -1) | ||||
Contra-tampão (pKa +1) | MES (6.10) | MOPS (7,20) | HEPES (7,50) | tricina (8,15) |
etanolamina (9,50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
bis-tris (6,40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
piridina (5,18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabela 1. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP aniónico onde o LE é 100 mM de HCl e 200 contra-ião buffer mM.
TE catiônica (pKa +1) | ||||
Contra-tampão (pKa -1) | etanolamina (9,50) | tris (8,08) | bis-tris (6,40) | piridina (5,18) |
MES (6.10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7,20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7,50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricina (8,15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabela 2. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP catiónico onde o LE é 100 mM de sódio e 200 contra-ião buffer mM.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos o financiamento da DARPA Micro / Nano Fluidics patrocinado Foco Fundamentos (MF3) Centro sob o número contrato N66001-10-1-4003, e da DARPA concessão N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.