El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

1. Física de la PTI ITP constituye un límite claro entre el movimiento de iones de carga similar. La técnica se puede realizar con las muestras aniónicos o catiónicos, pero nosotros adaptamos esta introducción a ITP aniónico y tenga en cuenta los mismos principios se aplican a ITP catiónico. Elegimos tampones LE y TE de tal manera que los iones LE tienen magnitud mayor movilidad electroforética efectiva. La movilidad electroforética μ eficaz, = U / E, es la constante de proporcionalidad entre campo eléctrico aplicado, E, y velocidad de desplazamiento de iones, U. 13 Establecemos una interfaz difusa entre el LE y TE y aplicar un campo eléctrico dirigido desde el alta la conductividad LE zona en la zona de baja conductividad TE. El sistema establece rápidamente un fuerte gradiente en el campo eléctrico en la interfase PTI, debido al perfil de conductividad no uniforme. De acuerdo con su nombre (del griego "isos" significa "igual", "takhos" significa "velocidad"), TE LE iones y los viajes en la misma ve, uniformelocity, como resultado del campo eléctrico no uniforme y la conservación de la corriente (esto es la denominada "condición PTI", ver Figura 1). La interfaz de ITP se auto-afilado: LE iones que difunden en la experiencia TE zona de un fuerte flujo restaurar y volver a la zona principal (y viceversa para los iones de TE en la zona de LE). Los iones de ejemplo enfocar a esta interfaz si su movilidad eficaz en la zona de TE es mayor que las de los co-TE iones, y si su movilidad eficaz en la zona LE es menor que la de los LE co-iones (ver Figura 1). La auto-afilado y centrándose propiedades de ITP contribuir a la solidez de esta técnica y que ITP relativamente insensible a las perturbaciones de la interfaz (por ejemplo, debido a la presión impulsada por el flujo o cambios en la geometría, como contracciones, expansiones, y vueltas). En el modo de pico de ITP (ver Figura 2a y Videos 1-2), las concentraciones de iones de la muestra sonen todo momento, significativamente menor que las concentraciones de TE LE y de iones y por lo tanto contribuye de manera insignificante a la conductividad local. La distribución de los iones de la muestra se determina por el interfaz de autoafilado entre las zonas de vecinos (aquí el TE y LE) y el valor de la movilidad muestra efectiva en relación con estas zonas. 14 iones de la muestra Múltiples centrarse dentro de la misma zona estrecha interfaz ITP como en gran parte superposición de picos. Las anchuras de interfaz y pico, así como el factor de preconcentración asociado, escala inversamente con la corriente aplicada (ver experimentos en la Figura 2b). 14 Para concentraciones de la muestra lo suficientemente altas iniciales y el tiempo de la acumulación de suficientes iones de la muestra alcanza un valor umbral de concentración. Por totalmente ionizados especies, este valor está determinado por la función reguladora Kohlrausch (KRF). 15 Para electrolitos débiles, se determina por las funciones Alberty y Jovin 16,17. En mesetamodo, como se ilustra en la Figura 3 y Video 3, iones de la muestra separar y purificar en zonas de concentración localmente uniforme y constante en un orden determinado por su movilidad efectiva. Iones muy diluidas todavía puede centrarse en el modo de pico entre las zonas de la meseta. En ITP, iones de la muestra puede ser introducido en una inyección finito entre el TE y LE (ver Figura 3) o alternativamente mezclados con el TE y / o LE (ver Figura 2). Nos referimos a la mezcla en la zona de TE como "semi-infinita" inyección, que puede ser utilizado para acumular iones analito continuamente. Acumulación continua de la muestra aumenta la sensibilidad en ambos picos y los ensayos de la meseta de modo. Sin embargo, las inyecciones finitos son más comunes en el modo de meseta. Esto es probablemente debido a altas concentraciones de analito iniciales en semi-infinita de la inyección puede aumentar sustancialmente la conductividad TE y tasas más bajas de enfoque. Además, la purificación completa no es posible en semi-infinita inyección (ya que no remains de una concentración finita en TE). 2. Dispositivo de limpieza y preparación Para los ensayos se presentan en este protocolo se utiliza isótropa húmedo grabado al agua fuerte (más o menos la sección transversal en forma de D) los chips de microfluidos de vidrio con un diseño a través del canal (ver Figura 1). La limpieza y el protocolo siguiente preparación está optimizado para los canales de sílice borosilicato y fundida, pero también se puede utilizar con vidrio / PDMS fichas. Lleve a cabo este procedimiento de limpieza antes de los experimentos para asegurarse de ejecutar para ejecutar la repetibilidad y la correcta aplicación de los recubrimientos de dinámicas necesarias para suprimir el flujo de electroosmótico (EOF). La omisión de este protocolo puede resultar en dispersión sólida de la interfaz de ITP. 14 Para descontaminar el canal, llenar el Norte, Este, Sur y embalses con 10-20 l de lejía al 10% y aplicar vacío en el depósito del oeste durante 2 min. Si se utiliza un estándar de Caliper chip de caddie, de vacío puede aplicarse de manera efectiva con sólo attaching el extremo ancho de una l 200 (sin filtrar) punta de la pipeta al depósito chip y conectar la línea de vacío a un tubo de 2 mm de diámetro interior. Vaciar los depósitos y enjuagar el canal (como en el paso 1) con hidróxido de sodio 1 M durante 2 min. Esta suavidad graba las paredes del canal, dando una superficie de borosilicato limpio para ayudar a establecer las propiedades de superficie uniforme. Vaciar los depósitos y limpia, con agua desionizada (DI), luego enjuague el canal con LE para ~ 2 min. Durante este período las propiedades superficiales y revestimientos dinámicos equilibre dentro del canal. 3. Fluoróforo centrándose en el modo de pico de ITP Preparar 1 ml LE consistente en 100 mM de HCl, 200 mM Tris, y 1% de PVP. Preparar 1 ml de TE que consta de HEPES 100 mM y 200 mM Tris. Combine 90 l de TE con 10 l de 1 micra Alexa Fluor 488 (AF488). Después de aclarar con LE, como se describe en la Parte 2, vacíe el depósito del oeste y limpiar un par de veces con DI en oder para diluir cualquier LE restante en el depósito. Rellene este depósito con 20 l de TE que contiene AF488. Colocar el electrodo positivo en el depósito Este y el suelo (negativo) de electrodos en el depósito Oeste y aplicar 2 mA (corriente constante). El pico de la muestra migrará a una velocidad constante desde el depósito al depósito Oeste Medio (ver Figura 1) y la tensión entre estos depósitos aumentará a medida que la menor conductividad TE llena el canal. 4. Extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de cultivo de E. E. La capacidad de enfocar de forma selectiva las especies iónicas hace ITP una técnica ideal para la preparación de muestras biológicas. Nos purificar ácidos nucleicos a partir de lisado de células no tratadas mediante la selección de un anión final con una magnitud menor movilidad eficaz que el ácido nucleico diana, pero mayor que la co-iónicos inhibidores de la PCR (por ejemplo, detergentes aniónicos, proteínas, y disolventes orgánicos, aunque esté presente en hila concentración de GH). Catiónico inhibidores de la PCR (por ejemplo, metales alcalinos y proteínas catiónicas y detergentes) migran en la dirección opuesta y así también se dejó atrás. ITP extrae y se concentra ácidos nucleicos diana desde el depósito de la muestra, dejando al mismo tiempo más lentas PCR inhibidoras especies detrás (ver Figura 4). Obtener una muestra de la cultura o E. células de E. a una densidad superior a 10 8 UFC / ml. Transferir 1 ml de cultivo celular en un tubo de microcentrífuga seguro de bloqueo y el precipitado por centrifugación a 4000 g durante 6 minutos. Vuelva a suspender el precipitado en 80 l RNasa libre de agua y se añaden 10 l de agente de lisis que consta de tricina 10 mM, 10 mM de Bis-Tris, 2 mM EDTA, 0,1% de Triton-X, y 5 mg / ml de lisozima. Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos. a temperatura ambiente (protocolo de lisis adaptado de Bercovici et al. 11). Añadir 10 l de hidróxido sódico 1 M para elevar el pH lisado a ~ 12,5. Suavemente activar la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta quela solución se aclare, en la que el punto de lisis se ha completado. Combinar 10 l de lisado con 90 l de tricina 50 mM y 100 mM Bis-Tris. Esta solución puede utilizarse ahora como el TE. Preparar 1 ml de LE que consta de 500 mM Bis-Tris, 250 mM de HCl, 1% de PVP, y 1X SYBR Green II. Llene el chip de microfluidos con LE, como se describe en la Parte 3. Con el fin de extraer el ácido nucleico purificado por fuera del chip análisis después de ITP, reemplazar el contenido del depósito Este con un LE-PCR compatible que contiene 50 mM Tris-bis, 25 mM de HCl, y 0,1% de PVP. Aplicar 1000 V entre el Este y el Oeste de los pozos comenzar el experimento. La corriente entre estos depósitos se reducirá. Al final del experimento la muestra se eluye en el depósito de OI. Coincidiendo con esta elución, el tiempo frente al actual de este sistema por lo general alcanza un valor de meseta (ya que la resistencia está ahora dominada por los iones TE distribuidas uniformemente dentro del canal). Mezclar con cuidado el depósitocontenidos por parte de pipeteo repetido y extraer un volumen de 5 l para el análisis por RT-PCR cuantitativa. 5. La separación de los aminoácidos catiónicos con el modo de meseta de ITP y el trazador no de enfoque (OFN) para la visualización ITP se puede utilizar para separar y concentrar los iones pequeños en mesetas adyacentes y detectable entre el TE y LE. Esto permite la detección e identificación basados ​​en las propiedades fisicoquímicas, tales como la conductividad local, absorbancia UV, detección de la temperatura, o el índice de refracción. Aquí nos demuestran un no-centrado trazador (NFT) de ensayo donde se agrega un fluorescente, co-iónico especie a la LE. Esta especie fluorescente no se centra, pero su concentración se adapta a un campo eléctrico local, y permite así la visualización de las zonas de meseta purificados (ver Figura 5). Preparar 1 ml LE consta de etanolamina 100 mM, 200 mM de tricina, y 1% de PVP, y 100 mM de la 6G fluoróforo rodamina catiónico. <li> Preparación 1 ml de TE que consta de 20 mM Tris, 40 mM de tricina. Preparar la muestra mediante la mezcla de 90 l de TE con 10 l cada uno de arginina 50 mM y 50 mM de lisina. Distribuir 20 l LE en el Oeste y los embalses del Norte y la muestra en el embalse de Oriente. Aplicar un vacío en el embalse del Sur durante 1 min. Enjuague bien con el Oriente DI y reemplazar con TE (TE sin muestra). Aplicar 500 V entre el este y el oeste de los embalses. 6. Los resultados representativos Se demuestra isotachopherograms de experimentos modo de pico en la Figura 2b y experimentos de extracción de ácidos nucleicos en la Figura 4. En los experimentos de modo pico con un reportero fluorescente (por ejemplo AF488, SYBR Green II), la intensidad de fluorescencia en general se pueden integrar y se compara con una curva de calibración para obtener información de la concentración cuantitativa. 12 Adicionalmente, en experimentos de ácidos nucleicos de extracción, la muestra se deja eluir en tél LE depósito y se extrae con una pipeta para el análisis cuantitativo por RT-PCR. 10,12 Mostramos isotachopherograms meseta modo para la separación de aminoácidos en la Figura 5. La intensidad de fluorescencia (en relación con la intensidad de TE LE o zona) se puede utilizar para la identificación de zona, mientras que las anchuras de zona permitir la cuantificación. Figura 1. Isotachophoresis (PTI) es una técnica electrocinético utilizado en aplicaciones de microfluidos para la detección sensible y separación de iones. ITP ofrece la separación, enfoque selectivo, y la capacidad de preconcentración. Además, es extremadamente robusta e insensible a las perturbaciones físicas debido a su naturaleza auto-afilado. Iones de la muestra selectiva se centran entre un electrolito principal (LE) y final (TE) y viajan a través del microcanal a una velocidad constante determinada por la velocidad de los iones principales en la zona de LE. Iones de la muestraconcentrarse si su movilidad electroforética efectiva se encuentra entre corchetes por la movilidad efectiva de los iones de LE y TE. El esquema representa un experimento modelo de ITP en donde la muestra se centra de forma continua entre el LE y zonas de TE. Figura 2. Diluir la muestra se centran iones en modo "pico" de la PTI. a) Dos distinta diluido (c muestra << c LE) se centran en el modo de pico de las especies en la interfase formada entre el LE y zonas de TE. Únicamente la LE y TE determinar el campo eléctrico, como las especies de la muestra no contribuyen significativamente a la actual. Los iones de ejemplo son mezclados con TE (en una inyección semi-infinita) y centrarse juntos en un pico de aproximadamente gaussiana en la interfase de ITP. Centrándose criterio (que se muestra como desigualdades) se aplica a las especies fuertemente ionizados. b) Los experimentos muestran Alexa Fluor 488 (AF488) se centró en el modo de alta para una amplia gama de corrientes aplicadas (véase también Video 1). Ejemplo de ancho pico es inversamente proporcional a la corriente (por dispersión insignificante advectivo debido al flujo electroosmótico). 14 La interfaz de autoafilado es resistente a la dispersión debido a la presión impulsada por flujo (ver Video 2). Figura 3. Iones de la muestra en un foco de concentración lo suficientemente alta en el modo "meseta" y gobiernan la conductividad local. Por lo general introducen iones de la muestra en una inyección finita entre el TE y LE. En esta modalidad, los iones de la muestra por separado y el orden de acuerdo a su movilidad electroforética efectiva (ver video 3). Para las especies fuertemente ionizados, el TE y concentraciones de meseta de la zona están determinadas por la función reguladora de Kohlrausch (KRF, un conjunto invariante inicialmente por la zona LE). Diluir los iones de seguir centrándose en el modo de pico entre la meseta entre paréntesis de sus zonas de movilidad efectiva. Centrándose criterion (se muestra como la desigualdad) se aplica a las especies fuertemente ionizados. Figura 4. Lisado preparación y extracción de ácidos nucleicos con PTI modo de pico. El ácido nucleico se extrae de E. E. cultivo celular utilizando lisozima asistido por lisis alcalina y se purificó mediante electroforesis selectivo centrado a través de ITP. TE mezclado con lisado (marrón) contiene ácido nucleico diana (verde), proteínas, y los potenciales químicos que inhiben la PCR. La selección apropiada de arrastre y que conduce iones permite selectiva de enfoque de ácido nucleico diana, dejando detrás de inhibidores de la PCR. Total de ácidos nucleicos pico de ITP a menudo adquiere una forma no ideal, como se muestra aquí en la imagen insertada. Como una demostración de este ensayo, se extrajeron ácido nucleico total de bacterias gram-negativas, Escherichia coli (lisadas con una solución de hidróxido de sodio solo), NA purificada de lisado con PTI, recogidosel. se extrae material genético, y se realizó QRT-PCR para verificar la purificación exitosa de ARNr 16S (rojo) y del ADNr (verde) 16S de cultivo bacteriano Ciclos negativos del umbral de control para ARNr 16S (azul) y 16S rDNA (amarillo) fueron cada uno por encima de 30 ciclos. Se realizó QRT-PCR utilizando SYBR Green Power ARN a C T 1-Step Kit de Applied Biosystems con 150 nM adelante (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) y atrás primers (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC), en los ciclos térmicos condiciones recomendadas. Figura 5. No centrándose trazador (NFT) de ensayo para la separación y la detección de aminoácidos no marcados. a) Esquema del ensayo NFT. Una inyección finito de iones de la muestra se introduce en el canal de Oriente. Mezclamos la LE con un fluoróforo marcador catiónico con menor movilidad eficaz que los iones de TE (trazador μ <μ TE). El fluoróforose dice que actúa como un "marcador underspeeding". A medida que el fluoróforo electromigrates de la LE en zonas ahora ocupadas por mesetas muestra y TE, experimenta un campo eléctrico más elevado y, por tanto su concentración aumenta. Este cambio en la concentración crea pasos en el isotachopherogram. b) Separación de dos aminoácidos, arginina y lisina, utilizando el ensayo de NFT con Rodamina 6G como el trazador underspeeding fluorescente. El pico ligero entre el TE y arginina es común en ITP, no se entiende bien, y aquí no interfiere con la detección o cuantificación de las mesetas. Película de consulta 1. 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