On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

1. Fysica van ITP ITP vormt een scherpe bewegende grens tussen ionen van soortgelijke kosten. De techniek kan worden uitgevoerd met anionische of kationische monsters, maar we passen deze inleiding tot anionische ITP en noteer dezelfde principes van toepassing op kationische ITP. We kozen LE en TE buffers zodat LE ionen hogere mate doeltreffende elektroforetische mobiliteit. De effectieve elektroforetische mobiliteit, μ = E / E, is de evenredigheidsconstante tussen elektrisch veld, E, en ion drift snelheid, U 13. We hebben een diffuse interface tussen de LE en TE vast te stellen en toe te passen een elektrisch veld gestuurd vanuit de high- geleidbaarheid LE zone van de lage-geleidbaarheid TE zone. Het systeem wordt snel een sterke helling in elektrisch veld in de ITP interface door de niet-uniforme geleidbaarheid profiel. Volgens zijn naam (van het Grieks, "isos" betekent "gelijk", "takhos", "snelheid" betekent), TE en LE-ionen reizen op dezelfde, uniforme velocity als gevolg van de niet-uniforme elektrische veld en het behoud van stroom (dit is de zogenaamde "ITP toestand", zie figuur 1). Het ITP-interface is zelfslijpende: LE ionen die diffunderen in de TE-zone ervaring een sterk herstel van flux en terug te keren naar de leidende zone (en vice versa voor TE-ionen in de LE-zone). Voorbeeld ionen zich in dit interface als de effectieve mobiliteit in de TE zone groter is dan die van de TE co-ionen en hun effectieve mobiliteit in de LE zone kleiner is dan die van de LE co-ionen (zie figuur 1). De zelfslijpende en zich te concentreren eigenschappen van ITP bijdragen aan de robuustheid van deze techniek en maak ITP relatief ongevoelig voor storingen van de interface (bijv. als gevolg van druk-gedreven stroming of veranderingen in de geometrie, zoals weeën, uitbreidingen, en slagen). In de piek modus ITP (zie Figuur 2a en Video's 1-2), monster ion concentratiesaltijd aanzienlijk lager dan LE en TE ionconcentraties en dus verwaarloosbaar bijdragen tot lokale geleidbaarheid. De verdeling van het monster ionen wordt bepaald door de zelfslijpende interface tussen aangrenzende zones (hier de TE-LE) en de waarde van het monster effectieve mobiliteit opzichte van deze zones 14. Meerdere monsters ionen zich binnen hetzelfde smalle ITP raakvlak regio grotendeels overlappende pieken. De interface en piekbreedte, alsmede de bijbehorende preconcentratiestap factor schaal omgekeerd evenredig met de toegepaste stroom (zie experimenten in figuur 2b) 14. Voor voldoende hoge initiële concentraties in het monster en voldoende accumulatie tijd, sample-ionen tot een drempelconcentratie waarde. Voor volledig geïoniseerd soorten, wordt deze waarde bepaald door de Kohlrausch regulerende functie (KRF). 15 Voor zwakke elektrolyten, wordt bepaald door de Alberty en Jovin functies. 16,17 In plateaustand zoals weergegeven in figuur 3 en Video 3 monster ionen scheiden en zuiveren tot zones lokaal uniforme en constante concentratie in de volgorde bepaald door de effectieve mobiliteit. Zeer verdunde ionen kan nog steeds richten in de piek-modus tussen de plateau zones. In ITP kunnen monster ionen worden ingevoerd in een eindige injectie tussen TE en LE (zie figuur 3) of afwisselend vermengd met de TE-en / of LE (zie figuur 2). Wij verwijzen naar menging in de TE zone "semi-oneindig" injectie, die kan worden gebruikt om continu accumuleren analyt ionen. Continu monster accumulatie verhoogt de gevoeligheid in zowel piek en plateau-modus testen. Echter, eindige injecties komen vaker voor in plateau-modus. Dit is waarschijnlijk omdat de hoge aanvankelijke analytconcentraties in semi-oneindige injectie kan aanzienlijk te verhogen TE geleidbaarheid en een lagere focussen tarieven. Ook volledige reiniging niet mogelijk is semi-oneindig injectie (er remains een eindige concentratie TE). 2. Inrichting reinigen en behandelen Voor de testen die in dit protocol gebruiken we isotroop nat-geëtst (ongeveer D-vormige dwarsdoorsnede) glas microfluïdische chips met een cross-channel ontwerp (zie figuur 1). De volgende reinigen en behandelen protocol is geoptimaliseerd voor borosilicaat en gesmolten silica kanalen, maar kan ook worden gebruikt met glas / PDMS chips. Voer deze schoonmaak procedure voorafgaand aan de experimenten uit te voeren-to-run herhaalbaarheid en de succesvolle toepassing van dynamische coatings die nodig is om elektro-flow (EOF) te onderdrukken garanderen. Het overslaan van dit protocol kan leiden tot een sterke verspreiding van de ITP-interface. 14 Om het kanaal te ontsmetten, vul het Noorden, Oosten en Zuid-reservoirs met 10-20 pl van 10% bleekwater en toe te passen onderdruk bij de West reservoir voor 2 minuten. Bij gebruik van een standaard Remklauw chip caddy, kan vacuum effectief kunnen worden toegepast door simpelweg attaching het brede einde van 200 pi (ongefilterde) pipet op de chip reservoir en het verbinden van de vacuümleiding een 2 mm binnendiameter buis. Leeg de reservoirs en spoel het kanaal (zoals in stap 1) met een M natriumhydroxide gedurende 2 minuten. Deze etsen voorzichtig het kanaal wanden, waardoor een schoon borosilicaat oppervlak om te helpen een uniforme oppervlakte-eigenschappen vast te stellen. Leeg de reservoirs en schoon met gedeïoniseerd water (DI), dan spoel het kanaal met LE voor ~ 2 minuten. Gedurende deze periode oppervlakte-eigenschappen en dynamische coatings evenwicht binnen het kanaal. 3. Fluorofoor richten in de piek-modus ITP Bereid 1 ml LE bestaande uit 100 mM HCl, 200 mM tris en 1% PVP. Bereid 1 ml TE bestaande uit 100 mM HEPES en 200 mM tris. Combineer 90 ul van TE met 10 ul 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488). Na spoelen met LE, zoals beschreven in deel 2, leeg de West-reservoir en maak een paar keer met DI in of in deder elke LE nog in het reservoir te verdunnen. Vul dit reservoir met 20 pi TE met AF488. Plaats de positieve elektrode in het Oosten reservoir en de grond (negatieve) elektrode in het Westen reservoir en toe te passen 2 uA (constante stroom). Het monster piek migreren een constante snelheid uit het Westen reservoir naar het oosten reservoir (zie figuur 1) en de spanning tussen deze reservoirs toenemen als de onderste geleiding TE vult het kanaal. 4. Extractie en zuivering van nucleïnezuren uit gekweekte E. coli De mogelijkheid om selectief te richten ionen maakt ITP een ideale techniek voor biologisch monster voorbereiding. We zuiveren nucleïnezuren van onbehandelde cellysaat door het selecteren van een trailing anion met een effectieve mobiliteit van grootte lager is dan het doelnucleïnezuur maar hoger dan co-ionische PCR-remmers (zoals anionische detergenten, eiwitten en organische oplosmiddelen, ook al aanwezig in high concentratie). Kationische PCR remmers (bijvoorbeeld alkalimetalen en kationische eiwitten en detergentia) migreren in de tegenovergestelde richting en dus ook achter. ITP onttrekt en zich target nucleïnezuren van het monster reservoir, terwijl lagere PCR-remmende species achter (zie figuur 4). Zorg voor een steekproef van of cultuur E. coli-cellen met een dichtheid groter dan 10 8 CFU / ml. Breng 1 ml celcultuur in een safe-lock microcentrifugebuis en pellet door centrifugeren bij 4000g gedurende 6 minuten. Resuspendeer de pellet in 80 ul RNAse-vrij water waarna 10 pi van lyseermiddel bestaande uit 10 mM tricine, 10 mM bis-tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, en 5 mg / ml lysozym. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur (lyseren protocol aanpassing van Bercovici et al.. 11). Voeg 10 pi 1 M natriumhydroxide om de pH te verhogen tot lysaat ~ 12.5. Voorzichtig bedienen de pipet op en neer totde oplossing wordt helder, en op dat moment lyserende is voltooid. Combineer 10 pi van lysaat met 90 pi 50 mM en 100 mM tricine bis-tris. Deze oplossing wordt gebruikt als TE. Bereid 1 mL LE bestaande uit 500 mM bis-tris, 250 mM HCl, 1% PVP en 1X SYBR Green II. Vul de microfluïdische chip met LE zoals beschreven in deel 3. Om het gezuiverde nucleïnezuur extract voor off-chip analyse na ITP, vervangen inhoud van het reservoir East een PCR-compatibele LE bevattende 50 mM bis-tris, 25 mM HCl en 0,1% PVP. Breng 1000 V tussen de Oost-en West putten om het experiment te beginnen. De huidige tussen deze reservoirs afnemen. Aan het einde van het experiment monster elueert in de LE reservoir. Tegelijk met deze elutie, de huidige versus tijd voor dit systeem bereikt meestal een plateau-waarde (sinds weerstand nu wordt gedomineerd door TE ionen gelijkmatig verdeeld in kanaal). Meng voorzichtig het reservoirinhoud door herhaalde pipetteren en pak een 5 ul volume voor analyse met behulp van kwantitatieve RT-PCR. 5. Scheiding van aminozuren met kationische plateau mode ITP en niet-gericht tracer (NFT) voor visualisatie ITP kan worden gescheiden en kleine ionen zich in aangrenzende en detecteerbaar plateaus tussen TE en LE. Dit maakt detectie en identificatie op basis van fysisch-chemische eigenschappen, zoals lokale geleidbaarheid, UV-absorptie, temperatuur sensor, of brekingsindex. Hier tonen een niet-richt tracer (NFT) assay wanneer een fluorescente, co-ionen wordt toegevoegd LE. Deze fluorescerende soort niet gericht, maar de concentratie aanpast aan een lokaal elektrisch veld en daarmee maakt visualisatie van gezuiverd plateau zones (zie figuur 5). Bereid 1 ml LE bestaande uit 100 mM ethanolamine, 200 mM tricine en 1% PVP en 100 pM van de kationogene fluorofoor Rhodamine 6G. <li> Prepare 1 ml TE bestaande uit 20 mM Tris, 40 mM tricine. Bereid monster door mengen 90 ul TE met 10 pi 50 mM elk van arginine en lysine 50 mM. Spuit 20 ul LE in het Westen en Noord-reservoirs en proef in het Oosten reservoir. Breng vacuüm bij Zuid-reservoir voor 1 minuut. Spoel het Oosten met DI en te vervangen door TE (TE zonder monster). Breng 500 V tussen Oost-en West-reservoirs. 6. Representatieve resultaten We tonen isotachopherograms van piek stand experimenten in figuur 2b en nucleïnezuur extractie experimenten in figuur 4. In de piek modus experimenten met een fluorescerende reporter (bijv. AF488, SYBR Green II), de totale fluorescentie-intensiteit kunnen worden geïntegreerd en vergeleken met een ijkcurve kwantitatieve concentratie informatie te verkrijgen. 12 Bovendien, in nucleïnezuur extractie experimenten, is een voorbeeld mag elueren in thij LE reservoir en geëxtraheerd met een pipet voor analyse door kwantitatieve RT-PCR. 10,12 We tonen plateau mode isotachopherograms voor aminozuren scheiding in figuur 5. Fluorescentie-intensiteit (opzichte LE of TE zone intensiteit) kan worden gebruikt voor de identificatie zone, terwijl zone breedte mogelijk kwantificering. Figuur 1. Isotachophoresis (ITP) is een elektrokinetische techniek die gebruikt wordt in microfluïdische toepassingen voor gevoelige detectie en scheiding van ionen. ITP biedt een scheiding, selectief scherpstellen, en preconcentratiestap mogelijkheden. Bovendien is zeer robuust is en ongevoelig voor storingen fysische vanwege zelfslijpend aard. Voorbeeld ionen selectief richten van een leidende (LE) en achterrand elektrolyt (TE) en via de microchannel een constante snelheid bepaald door de snelheid van de leidende ionen in de LE zone. Sample-ionenrichten als hun effectieve elektroforetische mobiliteit wordt tussen haakjes door de effectieve mobiliteit van de LE en TE-ionen. Het schema toont een model ITP experiment waarbij monster continu richt zich tussen de LE en TE zones. Figuur 2. Verdunnen monster ionen focus in "piek mode" ITP. a) Twee verschillende verdunde (c monster << c LE) soorten focus in piek-modus op het grensvlak gevormd tussen de LE en TE zones. Alleen al de LE en TE bepalen het elektrisch veld, als monster soorten niet significant bijdragen aan de huidige. Voorbeeld ionen gemengd met TE (in een semi-oneindig injectie) en zich tezamen in een ongeveer Gaussische piek de ITP interface. Scherpstellen criterium (weergegeven als ongelijkheden) is van toepassing op sterk geïoniseerd soorten. b) Experimenten met Alexa Fluor 488 (AF488) richtte zich in de piek-modus voor een reeks van toegepaste stromen (zie ook VIDEO 1). Voorbeeld piekbreedte omgekeerd evenredig is met de huidige (voor verwaarloosbare advectief dispersie door elektro flow). 14 zelfscherpend interface tegen dispersie onder druk aangedreven flow (zie Video 2). Figuur 3. Voorbeeld bevat bij een voldoende hoge concentratie focus "plateau mode" en bepalen lokale geleidbaarheid. We meestal introduceren monster ionen in een eindige injectie tussen de TE en LE. In deze modaliteit, monster ionen gescheiden en volgorde van hun effectieve elektroforetische mobiliteit (zie Video 3). Voor sterk geïoniseerd soorten, zijn de TE en plateau zone concentraties bepaald door de Kohlrausch regulerende functie (KRF, een invariante set in eerste instantie door de LE-zone). Verdun ionen zich blijven richten in de piek-modus tussen plateau zones bracketing hun effectieve mobiliteit. Scherpstellen criterion (weergegeven als ongelijkheden) is van toepassing op sterk geïoniseerd soorten. Figuur 4. Lysaat voorbereiding en nucleïnezuur extractie met piek-modus ITP. Nucleïnezuur wordt uit E. coli cel culture met behulp van lysozym-assisted alkaline lyserende en gezuiverd door middel van selectieve elektroforetische richten via ITP. TE gemengd met lysaat (bruin) bevat doelnucleïnezuur (groen), eiwitten en potentiële PCR-remmende chemie. De juiste selectie van slepende en het leiden van ionen maakt selectieve concentratie van doelnucleïnezuur terwijl PCR-inhibitoren achter. Totaal nucleïnezuur ITP piek duurt het vaak op een niet-ideale vorm, zoals hier in de inzet afbeelding. Als bewijs van het vitro assay geëxtraheerd totale nucleïnezuur van gramnegatieve bacteriën, Escherichia coli (gelyseerd met natronloog alleen) gezuiverd NA uit lysaat gebruikt ITP, verzameldde afgezogen genetisch materiaal, en uitgevoerd qRT-PCR-analyses voor een succesvolle zuivering van 16S rRNA (rood) en 16S rDNA (groen) van bacteriële cultuur te verifiëren. Negatieve controle drempel cycli voor 16S rRNA (blauw) en 16S rDNA (geel) waren elk meer dan 30 cycli. We voerden qRT-PCR het gebruik van elektrische SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit van Applied Biosystems met 150 nM forward (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) en achteruit (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers, bij de aanbevolen thermische cycli omstandigheden. Figuur 5. Niet-richt tracer (NFT) assay voor scheiding en detectie van ongelabelde aminozuren. a) Schematische voorstelling van de NFT assay. Een eindige injectie van het monster ionen wordt in de Oost kanaal. We mengen de LE met een tracer kationische fluorofoor met effectieve mobiliteit lager dan de TE-ionen (μ tracer <μ TE). De fluorofoorMen zegt op te treden als een "underspeeding tracer". Omdat de fluorofoor electromigrates van de LE in zones nu bezet door monster plateaus en TE, maar ervaart een hoger elektrisch veld en daarmee de concentratie toeneemt. Deze verandering in de concentratie leidt tot stappen in de isotachopherogram. b) scheiden van twee aminozuren, arginine en lysine met de NFT assay met Rhodamine 6G de underspeeding fluorescerende tracer. De lichte piek tussen TE en arginine komt vaak voor bij ITP, is niet goed begrepen, en hier heeft geen invloed op het detecteren of de kwantificering van de plateaus. Aanvullende Movie 1. Klik hier om de aanvullende film te bekijken . Aanvullende Movie 2. Klik hier om de aanvullende film te bekijken . Aanvullende Movie 3. Klik hier om de aanvullende film te bekijken .