이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

1. ITP의 물리학 ITP는 같은 요금 이온 사이에 날카로운 감동적인 경계를 형성합니다. 기술은 음이온이나 양이온 샘플 수행하지만 재단사이 음이온 ITP에 대한 소개와 유의 동일한 원칙 양이온 ITP에 적용할 수 있습니다. 우리는 르 이온이 높은 진도​​ 효과적인 전기 영 동적 이동성이 있는지 등의 르와 TE 버퍼를 선택합니다. 효과적인 전기 영 동적 이동성, μ는 = U / E는, 응용 전기 분야, 전자 및 이온 드리프트 속도, U 사이에 일정한 비례이다. 13 우리는 르와 장비 사이에 확산 인터페이스를 설정하고부터 높은 감독 전기장을 적용 낮은 전도성 TE 영역에 전도성 르 영역. 시스템은 신속 비 균일한 전도성 프로파일에 의한 ITP 인터페이스에서 전기 분야에서 강력한 그라디언트를 설정합니다. 이름마다 동일한, 균일한했습니다에서 TE와 르 이온 여행 (그리스로부터, "isos"는 "takhos"는 "속도"를 의미, "평등"이라는 뜻)locity가 아닌 균일한 전기장과 전류의 절약의 결과로 (이것은 소위 "ITP 상태"이며, 그림 1 참조). ITP 인터페이스는 셀프 샤프닝됩니다 TE 영역의 경험으로 강력한 복원 자속을 무마하여 선도 지역 (그리고 르 영역에 TE 이온에 대한 반대의 경우)로 돌아갑니다 것을 르 이온. 샘플 이온은 TE 영역에서의 효율적인 이동성이 TE 공동 이온보다 큰 경우이 인터페이스에 초점을, 그리고 르 영역에서의 효율적인 이동성이 르 공동 이온 (그림 1 참조)보다 적은 경우. 이 기법의 견고에 기여하고 인터페이스 (예 : 같은 수축, 확장 및 회전과 같은 압력 구동 흐름이나 형상의 변화로 인한)의 방해로 ITP가 상대적으로 구별하게 셀프 샤프닝 및 ITP의 속성을 집중. 정상 모드 ITP (그림 2A 및 비디오 1-2 참조)에서 샘플 이온 농도입니다항상 르와 TE 이온 농도보다 훨씬 낮은, 따라서 지역 전도성에 negligibly 기여합니다. 샘플 이온의 분포는 인접 구역 간의자가 선명 인터페이스 (여기 TE와 르) 및 이들 영역에 상대적인 표본 효과적인 이동성의 가치에 의해 결정됩니다. 대부분으로 14 다중 샘플 이온은 같은 좁은 ITP 인터페이스 영역 내에 집중 봉우리 중복. 인터페이스와 최대 너비뿐만 아니라 관련 preconcentration 팩터, 적용 전류와 반대 스케일 (그림 2B의 실험 참조). 14 충분히 높은 초기 시료 농도 및 충분한 축적 시간의 경우 샘플 이온은 임계 농도 값에 도달합니다. 완전 이온화 종의 경우이 값은 Kohlrausch의 조절 기능 (KRF)에 의해 결정됩니다. 약한 전해질 15은 그게 Alberty과 Jovin 기능에 의해 결정됩니다. 고원에서 16,17모드, 그림 3과 샘플 이온들의 효과적인 이동성에 의해 결정 순서 로컬 균일하고 일정한 농도의 영역으로 분리하여 정화 비디오 3에 묘사된. 아주 묽은 이온은 여전히​​ 고원 지대 사이에 피크 모드에서 초점을 맞출 수 있습니다. ITP에서는 시료 이온은 TE와 르 (그림 3 참조) 사이에 유한 주입에 소개하거나 교대 TE 및 / 또는 LE (그림 2 참조)과 함께 혼합. 우리는 지속적으로 analyte 이온을 축적하는 데 사용할 수있는 '세미 무한 "주사로 TE 영역에 믹싱을 참조하십시오. 연속 샘플 축적 피크와 고원 모드 assays 모두에서 감도를 증가시킵니다. 그러나 유한 주사는 고원 모드에서보다 일반적인 수 있습니다. 세미 무한 사출 높은 초기 analyte의 농도가 크게 TE의 전도성과 낮은 초점 률을 높일 수 있기 때문에이 가능성이 높습니다. 또한, 완전한 정화가 (거기에 레마 이후 세미 무한 주사에 수 없습니다TE의 기능은 유한 농도). 2. 장치 청소 및 준비 이 프로토콜에서 제공 assays 위해 우리는 교차 채널 설계 (그림 1 참조)와 함께 isotropically (약 D-모양의 단면) 젖어 에칭처리된 유리 microfluidic 칩을 사용합니다. 다음 청소 및 준비 프로토콜은 borosilicate와 융합된 실리카 채널에 최적화되어 있습니다뿐만 아니라 유리 / PDMS 칩을 사용할 수 있습니다. 실행 대 실행 repeatability 및 electroosmotic 흐름 (EOF)을 억제하는 데 필요한 동적 코팅의 성공적인 응용을 보장하기 위해 사전 실험이 청소 절차를 수행합니다. 이 프로토콜의 누락은 ITP 인터페이스의 강력한 분산을 초래할 수 있습니다. 14 채널을 오염을 제거하다하려면 10 %의 표백제 10-20 μL와 북쪽 동쪽과 남쪽 저수지를 채우는 2 분 서쪽 저수지에서 진공을 적용합니다. 표준 캘리퍼스 칩을 캐디를 사용하는 경우 진공 효과적으로 간단하게 attachin하여 적용할 수g 폭 200 μL의 끝 (필터없는) 칩에 저수지에 피펫 팁 및 2mm 내경 관에 진공 라인을 연결. 저수지을 비우 2 분 1 M의 수산화 나트륨과 채널을 (1 단계) 린스. 이것은 부드럽게 균일한 표면 속성을 설정할 수 있도록 깨끗한​​ borosilicate 표면을하였으며, 채널 벽면을 파 놓았. 저수지 빈과 드 이온화된 물 (DI)과 깨끗한 후 ~ 2 분 르와 채널을 린스. 이 기간 동안 표면 특성과 역동적인 코팅 채널 내에서 평형. 3. 형광단는 정상 모드로 ITP에 초점 100 MM HCL, 200 MM 트리스, 그리고 1퍼센트 PVP로 구성된 하나 ML 르를 준비합니다. 100 밀리미터 HEPES 구성된 한 ML TE 200 MM 트리스를 준비합니다. 1 μm의 알렉사 형석 488 (AF488) 10 μl와 TE의 90 μl을 결합. 르와 rinsing 후에 같이 빈, 부 2에 서쪽 저수지를 설명하며하거나 DI와 몇 번 청소데르는 저수지에 남아있는 르를 희석합니다. 20 μL TE는 AF488를 포함하는으로이 저수지를 채웁니다. 동쪽 저수지에서 긍정적인 전극과 서쪽 저수지에서 지상 (부정적인) 전극을 놓고 2 μA를 (정전류) 적용됩니다. 샘플 피크는 서부 저수지에서 동쪽 저수지 (그림 1 참조)과 낮은 전도율 TE는 채널을 채우고으로 이러한 저수지 사이의 전압이 증가에 일정한 속도로 마이 그 레이션됩니다. 4. 교양 E.로부터 추출 및 핵산의 정화 대장균 선택적으로 이온 종을 집중할 수있는 능력은 생물 학적 샘플 준비를위한 이상적인 기술을 ITP 있습니다. 우리는 효과적인 이동성 진도 대상 핵산보다 낮은지만 공동 이온 PCR 억제제 (예 : 음이온 세제, 단백질 및 유기 용제, 경우에도 하이에 존재보다 높은과 후행 음이온을 선택하여 치료 세포 lysate로부터 핵산 정화GH 농도). 양이온 PCR 저해제 (예 : 알칼리 금속 양이온 단백질과 세제)은 반대 방향으로 마이 그 레이션하고 너무도 뒤에 남아 있습니다. 느린 PCR-억제 종 배후를 (그림 4 참조) 떠나는 동안 ITP는 샘플 저수지에서 대상 핵산을 추출하고 초점을 맞추고 있습니다. 의 샘플이나 문화 E.를 구합니다 밀도보다 큰 10 8 CFU / ML에 대한 대장균 세포. 6 분 대한 4천g에서 원심 분리하여 안전한 잠금 microcentrifuge 튜브 및 펠렛으로 한 ML 셀 문화를 전송합니다. 80 μL RNase없는 물에 펠릿를 다시 중지 및 10 밀리미터 tricine, 10 MM 비스 – 트리스, 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 트리톤-X, 5 밀리그램 / ML 라이 소 자임 구성된 에이전트를 lysing 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 5 분 동안 품어. 상온에서 (Bercovici 외에서 적응 lysing 프로토콜. 11). ~ 12.5로 lysate 산도 마련을 위해 1 M의 수산화 나트륨 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 피펫을 행동시키다 아래까지솔루션은 포인트 lysing이 완료되는, 분명해진다. 50 밀리미터 tricine 90 μL과 100 MM 비스 – 트리스와 lysate 10 μL을 결합. 이 솔루션은 현재 장비로 사용될 수 있습니다. 500 MM 비스 – 트리스, 250 MM HCL, 1 % PVP 및 1X SYBR 녹색 II로 구성된 르의 1 ML을 준비합니다. 같은 파트 3에서 설명한 르와 microfluidic 칩을 채웁니다. ITP에 따라 오프 칩 분석을 위해 정화 핵산을 추출하기 위해서는 50mM 비스 – 트리스, 25 MM HCL, 그리고 0.1 % PVP를 포함하는 PCR 호환 르와 동부 저수지의 내용을 바꿉니다. 실험을 시작하기 위해 동서 우물 사이에 1,000 V를 적용합니다. 이들 저수지 사이에 전류가 줄어 듭니다. 실험이 끝나면 예제 르의 저수지로 elutes. 이 용출과 일치하는,이 시스템의 현재 대 시간은 일반적으로 대지 값 (저항이 이제 균일 채널 내에 분산 TE 이온에 의해 지배되기 때문에)에 도달합니다. 부드럽게 저수지를 섞어작품 내용은 pipetting을 반복하고 정량 RT-PCR에 의한 분석을 위해 5 μL 볼륨 압축을 풉니다. 5. 시각화를위한 양이온 고원 모드 ITP와 비 초점 추적 (노퍽 표준시)과 아미노산의 분리 ITP는 TE와 르 사이에 인접한 및 감지 대지에 작은 이온을 분리해서 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 로컬 전도성, 자외선 흡광도, 온도 감지, 또는 굴절 지수와 같은 물리 특성을 바탕으로 탐지 및 식별이 가능합니다. 자, 형광등, 공동 이온 종은 르에 추가됩니다 아닌 초점 추적 (노퍽 표준시) 분석을 보여줍니다. 이 형광 종이 초점을 아니지만, 그 농도는 지역의 전기장에 적응함으로써 (그림 5 참조) 정화 고원 지대의 시각화를 가능하게합니다. 100 밀리미터 ethanolamine 구성된 한 ML 르, 200 밀리미터 tricine 및 1퍼센트 PVP와 양이온 형광단의 Rhodamine 6G의 100 μm의를 준비합니다. <리> 준비하십시오 하나 ML TE 20 MM 트리스, 40 밀리미터 tricine 구성된. 10 μL 50 밀리미터 아르기닌의 각과 라이신 50 밀리미터와 TE의 90 μL를 혼합하여 샘플을 준비합니다. 20 μL 서부 르와 동부 저수지의 북쪽 저수지와 샘플을 분배. 1 분 동안 남쪽 저수지에서 진공을 적용합니다. DI와 잘 이스트를 씻어 및 시험 장비 (샘플 제외 TE)로 바꿉니다. 동서 저수지 사이에 500 V를 적용합니다. 6. 대표 결과 우리는 그림 4에서 그림 2B와 핵산 추출 실험에서 피크 모드 실험 isotachopherograms을 보여줍니다. 형광 리포터 (예 : AF488, SYBR 녹색 II)와 피크 모드 실험에서는 전체적인 형광 강도가 정량 농도 정보를 얻을 교정 곡선으로부터 통합과 비교할 수 있습니다. 또한 12, 핵산 추출 실험에서 샘플을 elute 수 있습니다 t로그는 르 저수지 및 정량 RT-PCR. 10,12하여 분석을 위해 피펫으로 추출된 우리는 그림 5의 아미노산 분리를 위해 대지 모드 isotachopherograms을 보여줍니다. 영역 너비가 quantitation을 사용하면서 형광 강도는 (르거나 TE 지대 강도에 상대적), 영역 식별에 사용할 수 있습니다. 그림 1. Isotachophoresis (ITP)은 이온의 민감한 감지 및 분리를 위해 microfluidic 어플 리케이션에 사용되는 계면 기술이다. ITP는 분리, 선택 집중, 그리고 preconcentration 기능을 제공합니다. 또한, 그것은 매우 강력하고 있기 때문에 그 자체 선명하게 자연의 물리적인 방해로 구분하지 않습니다. 샘플 이온 선택적으로 르 영역에서 선도적인 이온의 속도에 의해 결정 일정한 속도로 microchannel 통해 선도 (LE)와 후행 전해질 (TE)와 여행 사이에 중점을 둡니다. 샘플 이온그들의 효과적인 전기 영 동적 이동성이 르와 TE 이온의 효과적인 이동성에 의해 괄호 경우 중점을 둡니다. 개략도 예제 르와 TE 영역 사이에 연속적으로 초점을 맞춘 모델 ITP 실험을 묘사. 그림 2. "정상 모드"ITP에서 샘플 이온 초점을 희석. ) 두 개의 묽은 (C 샘플 << C 르) 르와 TE 영역 사이에 형성된 인터페이스에서 정상 모드에서 수종 초점. 샘플 종 상당히 전류에 기여하지 않는 한 전적 르와 장비는 전기 필드를 결정합니다. 샘플 이온은 TE (세미 무한 주사)을 함께 혼합하고 ITP 인터페이스에서 대략 가우스 피크에 함께 집중. 포커싱 기준가 (불평등로 표시) 강하게 이온화 수종에 적용됩니다. b)는 알렉사 형석에게 488 (AF488)를 보여주는 실험 (또한 V를보고 응용 전류 범위 피크 모드에서 초점ideo 1). 샘플 피크 폭 (electroosmotic 흐름으로 인해 무시할 advective 분산의 경우) 전류에 반비례합니다. 14 셀프 샤프닝 인터페이스가 압력 중심의 흐름 (비디오 2 참조)에 의한 분산에 강한 것입니다. 그림 3. 샘플 "대지 모드"에서 충분히 높은 농도 초점에서 이온과 지방 전도성 적용됩니다. 우리는 일반적으로 장비와 르 간의 유한 주입에 샘플 이온을 소개합니다. 이러한 양상에서, 그들의 효과적인 전기 영 동적 이동성 (비디오 3 참조)에 따라 샘플 이온 분리 및 주문. 강하게 이온화 종 들어, TE 및 고원 지대 농도는 Kohlrausch의 조절 기능 (KRF, 르 영역에 의해 처음 불변량 세트)에 의해 결정됩니다. 희석 이온은 고원 지역의 bracketing들의 효과적인 이동성 사이 정상 모드에서 초점을 맞출 것을 계속한다. C를 중심으로riterion는 (불평등로 표시) 강하게 이온화 수종에 적용됩니다. 그림 4. 피크 모드 ITP와 준비와 핵산 추출 Lysate. 핵산은 E.에서 추출됩니다 라이 소 자임 이용한 알칼리 lysing을 사용하고 ITP를 통해 초점을 선택적 전기에 의해 정화 대장균의 세포 배양. lysate와 혼합 TE는 (갈색) 대상 핵산의 산성 (녹색), 단백질, 및 잠재적인 PCR-억제 화학 포함되어 있습니다. 이온 후행하고 선도의 적절한 선택은 뒤에 PCR 억제제를 떠나는 동안 표적 핵산의 중심으로 선택 가능합니다. 삽입된 페이지 이미지에 현재와 같이 총 핵산 ITP 피크는 종종, 비 이상적인 형태를 취한다. 이 분석의 시연으로 우리는 그람 음성 세균에서 총 핵산을 추출, ITP를 사용하여 대장균 (혼자 수산화 나트륨 용액으로 lysed), lysate로부터 정화 NA는 수집유전 물질을 추출하고, 16 rRNA (적색) 및 세균성 문화에서 16 rDNA (녹색)의 성공적인 정화를 확인 qRT-PCR 분석을 수행했습니다. 16 rRNA (파란색)과 16 rDNA (노란색)에 대한 부정적 제어 임계값주기는 각보다 30 사이클 있었다. 우리는 파워 SYBR 녹색 RNA – 투 – C T 권장 열 사이클링 조건 150 앞으로 NM (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) 및 역방향 (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers와 응용 Biosystems에서 1 단계는 키트를 사용 qRT-PCR을 수행. 그림 5. 비 초점 레이블이 지정되지 않은 아미노산의 분리 및 검출을위한 트레 이서 (노퍽 표준시) 분석합니다. 노퍽 표준시 분석의) 도식. 샘플 이온의 유한 주입은 이스트 채널에 소개된다. 우리는 TE 이온 (μ의 추적기는 <μ TE)보다 효과적인 이동성 낮은과 추적 양이온 형광단로 르를 섞는다. 형광단"underspeeding의 트레 이서 '역할을했다고한다. 형광단 이제 샘플 고원 및 시험 장비에 의해 점령 지역으로 르에서 electromigrates로서 높은 전기장 때문에 그것의 농도 증가를 경험한다. 농도에서이 변경 사항은 isotachopherogram의 단계를 만듭니다. B) 2 아미노산, 아르기닌과 라이신의 분리는 underspeeding 형광 트레 이서 등 Rhodamine 6G 제품과 함께 노퍽 표준시 분석을 사용합니다. TE와 아르기닌 사이에 약간의 피크는 ITP에 공통적으로 잘 이해되지 않으며 여기에 대지를 감지하거나 quantifying을 방해하지 않습니다. 보충 영화 1. 보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 보충 동영상 2. 보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 보충 영화 3. 보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .