على رقاقة Isotachophoresis للفصل بين الأيونات والتنقية من الأحماض النووية
Özet
Isotachophoresis (آي تي بي) هو فصل قوي حركي كهربي وتقنية preconcentration مع التطبيقات التي تتراوح بين اكتشاف السم إلى إعداد عينة. نستعرض المبادئ الفيزيائية للITP والمنهجية لتطبيق هذه التقنية لاثنين من التطبيقات مثال محدد: الفصل والكشف عن جزيئات صغيرة وتنقيتها من الأحماض النووية من المحللة ثقافة الخلية.
Abstract
تقنيات حركي كهربي هي من دعائم من التطبيقات الميكروسكيل نظرا لقدرتها الفريدة على أداء مجموعة متنوعة من العمليات fluidic والكهربي في النظم، وبسيط التعاقد مع أي أجزاء متحركة. Isotachophoresis (آي تي بي) هي تقنية بسيطة وقوية جدا حركي كهربي التي يمكن أن تحقق الفصل مليون أضعاف 1،2 preconcentration والكفاءة والاستخراج على أساس الحركة الأيونية. 3 على سبيل المثال، أننا أظهرنا تطبيق آي تي بي للانفصال وكشف حساسة من غير المسماة الأيونية جزيئات (السموم على سبيل المثال، الحمض النووي، والريباسي، ميرنا) مع ضئيلة أو معدومة عينة إعداد 4-8، واستخراج وتنقية الأحماض النووية من المصفوفات المعقدة بما في ذلك ثقافة الخلية والبول، والدم. 9-12
ITP يحقق التركيز والفصل باستخدام مجال تطبيق الكهربائية ومخازن 2 ضمن نظام قناة fluidic. لالتحاليل أنيوني، يتم اختيار الشركة الرائدة في مجال المنحل بالكهرباء (LE) العازلة قاوك أن الأنيونات لها أن تكون أعلى التنقل الكهربي فعالية من الأنيونات من المنحل بالكهرباء زائدة (TE) العازلة (التنقل الفعالة ويصف سرعة الانجراف ملاحظتها لايون، ويأخذ في الاعتبار حالة التأين من الأيونات، كما هو موضح بالتفصيل من قبل Persat وآخرون 13). بعد تأسيس حلقة وصل بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه، يتم تطبيق حقل كهربائي بحيث أيونات جنيه الابتعاد عن المنطقة التي تحتلها أيونات الشركة المصرية للاتصالات. يمكن الأيونات عينة من وسيط سباق التنقل فعال قبل الأيونات الشركة المصرية للاتصالات ولكن لا تجاوز أيونات جنيه، وبالتالي فهي تركز على واجهة LE-TE (وتسمى فيما بعد "واجهة آي تي بي"). علاوة على ذلك، الشركة المصرية للاتصالات والمناطق شكل جنيه من الموصلية المنخفضة على التوالي وارتفاع، والذي وضع حاد الانحدار الحقل الكهربائي في واجهة ITP. هذا التدرج حقل preconcentrates الأنواع عينة لأنها تركز. خيار مناسب لنتائج الشركة المصرية للاتصالات وجنيه في التركيز وتنقية من الأنواع المستهدفة من الأنواع غير المركزة الأخرى، وفي نهاية المطاف، والفصل 1د الفصل بين الأنواع عينة.
نستعرض هنا ITP المبادئ الفيزيائية التي يقوم عليها، ومناقشة وضعي معيار من العملية: "الذروة" و "الهضبة" وسائط. في وضع الذروة، ويخفف نسبيا الأيونات عينة تركيز معا ضمن تداخل القمم ضيق في واجهة ITP. في وضع هضبة، الأيونات عينة أكثر وفرة التوصل الى تركيز ثابت للدولة وفصل إلى مناطق مثل هضبة مجاورة امر بها الحركة على نحو فعال. الذروة والهضبة وسائط تنشأ من الفيزياء الكامنة نفسه، ولكنها تمثل الأنظمة متميزة تختلف عن تركيز تحليلها الأولي و / أو كمية من الوقت المخصص للتراكم عينة.
وصفنا 1 بالتفصيل وضع ذروة تجربة نموذجية وشرح بعد ذلك فحص وضع ذروة لاستخلاص الأحماض النووية من E. كولاي خلية ثقافة. نستنتج من خلال تقديم فحص وضع هضبة، حيث نستخدم عدم التركيز التتبع (NFT) الأنواع لتصور الانفصال ولكلتشكيل الكميات من الأحماض الأمينية.
Protocol
Discussion
قدمت وسائل تمكين ITP هنا الكشف السريع وحساسة وقوية والتعامل مع الجزيئات الأيونية. التحدي الرئيسي في استخدام آي تي بي هو الخيار السليم للمخازن جنيه والشركة المصرية للاتصالات. في آي تي بي أنيوني، نختار عادة كلوريد كما أنيون الرائدة لأنه هو حمض قوي مع الحركة المطلقة عالية جدا، وبالتالي لها خصائص يمكن التنبؤ بها جدا. لذلك، ينخفض عادة خيار عازلة في ITP أنيوني إلى اختيار الشركة المصرية للاتصالات المناسبة وcounterion. لانتقائية تركز التجارب، TE الاختيار أمر بالغ الأهمية لاستبعاد تلويث الأيونات. في التطبيقات حيث لا وجود الملوثات، وانخفاض TE التنقل فعال يؤدي إلى أسرع معدل من التركيز. نوصي باستخدام ما يلي، نسبيا حسن تصرف أنيوني أيونات الشركة المصرية للاتصالات: MES، المماسح، HEPES، tricine. اختيار counterion يؤثر على كل من درجة الحموضة النظام والشركة المصرية للاتصالات تنقل فعالة. counterions شيوعا هي تريس (الباكاف الحمضية 8.1) ومكرر تريس (الباكاف الحمضية 6.4). للفحوصات التي تتطلب درجة الحموضة أقل أو أعلى، فإننا نوصي بيريدين (الباكاف الحمضية 5.25) وإيثانولامين (الباكاف الحمضية 9.5)، على التوالي. في الجدولين 1 و 2، آي تي بي للأنيوني والموجبة، على التوالي، ونحن تلخيص عدة أمثلة العازلة مفيد. نحن نأخذ حمض الهيدروكلوريك كما أيون جنيه أنيوني والصوديوم وأيون جنيه الموجبة، ونحن نفترض 100 قوة الأيونية ملم من المنطقة العازلة جنيه.
والقارئ لاحظ أن قوة أيونية عازلة في بروتوكولات لدينا (والجداول 1-2) هي دائما أكبر من أو يساوي 10 مم. بينما في نظرية فيزياء ITP ينطبق على القوة الأيونية أقل من 10 ملم، والملوثات الطبيعية (حامض الكربونيك على سبيل المثال من التفاعل بين الماء وغاز ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي) بالقرب من مستوى ملي 1 غالبا ما تحد من الاستخدام العملي للمنخفض مخازن القوة الأيونية.
نلاحظ أن لا يقتصر إشارة آلية تنبيغ لفحوصات الواردة في هذا البروتوكول. كما يمكن مناقشتها بإيجاز في الجزء 5، في وضع هضبة تنقية مناطق يمكن اكتشافها من خلال التغييرات في الموصلية المحلية، والأشعة فوق البنفسجية absorبانس، ودرجة الحرارة، أو مؤشر الانكسار. في المجموعة الخاصة بنا، وقمنا بتطوير طريقة التي تستخدم ampholytes الناقل فلوري للكشف عن الحساسية، وتحديد من analytes غير معروف. (5) والتجارب وضع الذروة، ويمكن استخدام مجسات خاصة لتسمية التحاليل تركيزا. في مثال واحد، ونحن نستخدم منارات الجزيئية – تحقيقات قليل النوكليوتيد أن يتألق على تهجين تسلسل إلى هدفهم – للكشف عن الحمض النووي المستهدف أو جزيئات الحمض النووي الريبي مع خصوصية عالية 11،18.
في حين ITP قوية نسبيا إلى التشتت الناجم عن الضغط يحركها تدفق وEOF، EOF المفرط يمكن أن يؤدي إلى ركود واجهة ITP، حيث سرعة EOF يعني يصبح مساويا لسرعة ITP. 14 EOF قوي مثل هذا يحدث خصوصا في ظل ظروف ارتفاع درجة الحموضة والقوة الأيونية منخفضة. لهذا السبب، من المستحسن استخدام العازل مع درجة الحموضة (8) أو أقل، ومع القوة الأيونية بناء على أمر من 100 مم إذا مريحة. في تجربتنا، هو PVPمعظم طلاء فعالة لقمع EOF في رقائق البورسليكات. ومع ذلك، لما له من خصائص النخل، قد PVP لا يكون مناسبا لبعض التطبيقات، مثل التركيز الحمض النووي الجيني. في التجارب، ونحن نلاحظ أن إضافة PVP يمكن أن يقلل كثيرا الجينومية التنقل الحمض النووي المطلق (لدرجة أنها لا تركز). في هذه الحالات يمكن للطلاء silanol مثل Sigmacote في الاقتران مع السطحي (مثل تريتون-X 100) أيضا أن تكون فعالة في الحد من EOF. 10
| TE أنيون (الباكاف الحمضية -1) | ||||
| التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية +1) | MES (6.10) | اجتماعات الأطراف (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
| إيثانولامين (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
| تريس (8.08) | 21.00 | 19.23 </ TD> | 15.84 | 17.56 |
| مكرر تريس (6.40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
| بيريدين (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
الجدول رقم 1. فعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP أنيوني حيث هو 100 جنيه حمض الهيدروكلوريك ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت.
| TE الكاتيون (الباكاف الحمضية +1) | ||||
| التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية -1) | إيثانولامين (9.50) | تريس (8.08) | مكرر تريس (6.40) | بيريدين (5.18) |
| MES (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
| MOPS (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
| HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
| Tricine (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
الجدول 2. الفعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP الموجبة حيث هو 100 جنيه الصوديوم ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن الامتنان على تمويل من ترعاه DARPA مايكرو / نانو التركيز أساسيات Fluidics (MF3) مركز تحت رقم العقد N66001-10-1-4003، ومنحة من داربا N660001-09-C-2082.
Materials
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
| Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
| Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
| hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
| Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
| tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
| bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| EDTA | GIBCO | AM9260G | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
| ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
| Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
| L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
| EQUIPMENT | |||
| Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
| Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
| Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
| Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
| Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
| Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
| Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | |
Table 3. Specific reagents and equipment.
Referanslar
- Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
- Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
- Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
- Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
- Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
- Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
- Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
- Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
- Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
- Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
- Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
- Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
- Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
- Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
- Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
- Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).
