İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Çözülme ES hücrelerinin (Video Öne değil) ES hücrelerinin% 10 DMSO içeren ortamda dondurulur. DMSO ES hücrelerinin farklılaşması uyarabilir, bu gün geç hücreleri çözünmesi mümkün olabilir ve böylece artık DMSO etkilerini en aza indirmek için ertesi sabah orta değiştirmek için. 6-iyi bir doku kültürü en az 15 dakika süreyle% 0,1 jelatin ile plaka ve levha hücrelere hemen önce aspire Coat. Çözülme ES hücreleri 37 ° C su banyosunda (yaklaşık 5 x 10 6 hücre, bir konfluent 6-iyi eşdeğer) ve prewarmed ES hücre orta içine 10 ml seyreltik. Pelet, bir tezgah üstü klinik santrifüj 1000 rpm'de 10 dakika boyunca iplik hücreleri. 10 ml 37 ° C prewarmed orta orta ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. Transferi hücre 6 plaka süspansiyon ve 37 büyümeye ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör. Ertesi gün, ölü hücreler ve artık DMSO kaldırmak için, orta değiştirin. Passage genişlemesi ve ES hücre kültürleri ES hücrelerinin 2 / 3 gün rutin olarak her geçişli, ve orta alternatif gün değiştirilir. Böylece, ES hücreleri günlük dikkat gerektirir. Bizim tecrübelerimize göre, besleyici bağımsız ES hücrelerinin hızla büyümeye ve hızlı bir şekilde sarı dönüm, orta asitlenir. Hücreleri (her gün değişen medya ya da çok düşük bir seyreltme hücreler Pasajlanması) orta asitlenir izin vermek totipotency garanti edilemez sonra, aşırı farklılaşması ve hücre ölümünü tetikler, hücrelerin krizi geçirmesi neden olacaktır. Hücreleri izdiham ulaşmadan büyük öbekler oluşturacak ve bu yığınlara içinde hücreler ayırt veya ölecek gibi çok düşük bir yoğunlukta, geçiş sırasında hücrelerin yetersiz dağılım, ya da düzensiz kaplama Kaplama hücreleri, benzer sorunlara yol açabilir. Germline iletim enjeksiyon zaman sağlıklı görünse bile, kötü muamele edilmiş hücreler önemli ölçüde azaltmıştır. Bir hücre konfluent 6 plaka orta aspirat ve hücrelerin uzak pipetleme, 2-3 ml 37 ° C prewarmed PBS ile yıkayın. 1 1 ml × hücreler küçük öbekler halinde eşit dağılmış kadar 3-4 dakika veya tripsin çözüm hücreleri Kapak. Tripsin inaktive orta 1 ml ekleyin. Taze jelatinize 6 plaka tripsinize hücreleri ve plaka hücreleri (genellikle kuyu 2 / 5) toplayın. Donma ES hücreleri Yukarıda açıklandığı gibi konfluent 6-iyi bir plaka Trypsinize (yaklaşık 1 × 10 7 hücreleri). 1000 rpm'de 5 dakika boyunca orta ve pelet 9 ml tripsinize hücreleri toplayın. 1 ml taze hazırlanmış dondurma orta, orta ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire edin. Iki cryotubes içine kısım hücre 0,5 ml. Şişeleri Freeze -80 ° C gecelik ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen transfer. ChIP-on-chip PROSEDÜRÜ Immunoprecipitation Formaldehit crosslinking hücreleri (süspansiyon hücreleri için) Her immunoprecipitation için 1 x 10 8 hücre – 5 x 10 7 kullanın. % 1 konsantrasyonda hücre süspansiyonu taze Formaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika Formaldehit Çözüm hücreleri kuluçkaya. Formaldehit gidermek için 1 / 10 hacmi 1,25 M glisin ekleyin. 10 ml 1x PBS ile iki kez hücreleri durulayın. Havuz, 50 ml konik tüpler hücreler ve 4 5 dakika 700g spin ° C Lizis Buffer 1.5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. 1.5 ml mikrofuge'de tüp hücrelerin aktarın. Flash-freeze üç kez sıvı nitrojen içinde hücre ve hücreler kırmak için bir doku değirmeni kullanın. Hücreleri çapraz bağlı, onlar -80 ° C süresiz dondurularak saklanmalıdır. (Adımlar 4 ° C yapılır) manyetik boncuk hazırlanması 1,5 ml düşük tutma mikrotüp Dynal boncuk 50 ul ekleyin. Immunoprecipitation her boncuk 1 tüp ayarlayın. 1 ml Blok Çözüm ekleyin. Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Manyetik rafa yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 15 saniye almalıdır Boncuk toplamak için yardımcı olmak üzere iki kez rafa tersine çevirin. Pipet ile süpernatantı. Hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit çıkarmadan 1 ml Blok Çözüm ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk boncuk eşit olarak 10-20 kat ya kadar veya tekrar süspansiyon haline getirin. (Adım 2) Yukarıdaki gibi boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. Adım 3, bir kez daha, 1.5 ml Blok Çözüm boncuk yıkayın. 750 ul Blok Çözüm boncuk süspanse edin ve 10 mikrogram antikor ekleyin. Rotator, ya da bir gecede, 6 saat, en az 4 ° C'de inkübe. Boncuk üç t yıkayınAdım 3 açıklandığı gibi, 1 ml Blok Çözüm IME'ler. Hücre sonication Sonication için borular ° C ve transfer hücreleri -80 dondurulmuş hücre pelletleri çıkarın. Şu anda sonication için standart bir polupropylene altında, 15 ml konik tüpü kullanmayı tercih. Biz 5 ml işareti de iki adet tüp kesme ve üst yarısında atın. Kurarken Tüpler parafilm veya tüp kap ile karşılanabilir. Sonikatör probu üzerinde yaklaşık 0.5-1.0 cm tüp alt oturur mikrofuge'de tüp raf, pozisyon tüp kullanma. Prob merkezli ve tüp kenarlarına temas etmediği dikkat edin. (Probe konumlandırma çözüm köpükler olsun ya da olmasın sonication sırasında etkileyebilir. Tipik olarak, köpük sonicated DNA kötü makaslanmış olacağını gösterir.) Süspansiyon 20 sn boyunca 6 kez sonikasyon Örnekleri sonication sırasında bir buz-su banyosunda tutulmalıdır. Başlangıçta 0 olan çıkış gücü, köpük azaltmak ve ilk patlama sırasında nihai güç elle artırmak için. (Köpük önemli varsa, tüm kabarcıklar hiçbir köpük kabarcıkları bırakarak, tüm malzeme yumuşak tabanda takip 20.000 g de santrifüj tarafından kaldırılmış olabilir.) Spin 20.000 g de 10 dakika 4 ° C pelet enkaz ve 1.5 ml tüp hasat süpernatantı. Giriş DNA gibi her örnekten 50 ul hücre lizat kaydedin. -20 ° C'de muhafaza Sonikasyon lizat toplu başına en az bir giriş DNA kısım tutulmalıdır. Sonication ve parça boyutları ortaya çıkan dağılım etkileri etkileri sadece çapraz ters ve DNA saflaştırılması sonra kontrol edilebilir unutmayın. Kromatin immunoprecipitation Hücre sonication 1 x 10 8 hücre, son hacim 1 ml (Bu manyetik boncuk, Adım 6 hazırlanması 50 ul antikor / manyetik boncuk karışımı 4 adım – 5 x 10 7 kromatin-eşdeğer miktarda ekle Lizis Tampon, hiç) ile ayarlamak mümkündür. 4 rotator gece inkübe ° C Yıkama Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Raf yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 20 sn olmalıdır Tüm boncuk toplamak yardımcı olmak için iki kez rafa tersine çevirin. Örnekleri arasında değişen ipuçları, pipet ile süpernatantı. Her tüpe 1 ml Lizis Tampon ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk ekleyin. 10-20 kat veya boncuk eşit yeniden süspanse kadar – Bu hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit kaldırarak olabilir. Boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. Yıkar arasında değişen ipuçları, bu yıkama 5 kez daha tekrarlayın. Adım 2'de açıklandığı gibi 1 ml IP1 Tampon, boncuk, 6 kez yıkayın. Adım 2'de açıklandığı gibi, 1 ml IP2 Tampon boncuk 6 kez yıkayın. Adım 2'de açıklandığı gibi 1 ml TE 8.0 Buffer, boncuk, 6 kez yıkayın. Spin 960g az 3 dakika 4 ° C ve herhangi bir kalıntı TE Tampon kaldırmak. Elüsyon Tüpler 15 dakika süreyle 65 ° C su banyosunda inkübe boncuk Elüsyon Tampon ve Zehir malzeme 210 ul ekleyin. Kısaca Vorteks her 2 dk. Bu kuluçka eluat kurtarma geliştirmemize yardımcı olabilecek 30 dakika gibi uzun olarak uzatılabilir. G oda sıcaklığında 1 dakika 16.000 boncuk aşağı spin. 200 ul süpernatant çıkarın ve yeni bir tüpe transfer. Malzeme -20 ° C'de dondurulmuş ve geceleme saklanabilir. Çapraz bağ ters 6 saat ve en fazla 15 saat (daha uzun çapraz ters genellikle mikroarray analizi artan gürültü sonucu) bir en az 65 ° C'de inkübe Elüsyon, Adım 3 immunoprecipitation DNA çapraz Ters . Bu kuluçka tüp eşit olarak ısıtılır ve oluşan az yoğunlaşma yoktur, böylece bir fırında yapılabilir. Sonication sonra saklıdır giriş DNA (Adım 13) 50 ul çözülme, 150 ul (3 cilt) elüsyon tampon ve karışımı ekleyin. 65 ° C çapraz bağ ters Adım 1 inkübe edilmesiyle bu giriş DNA çapraz Ters. Bu noktadan itibaren, her tüp immunoprecipitation veya giriş DNA sonraki adımlarda işlem için ayrı bir tüp veya numune olarak kabul edilir. Arıtma DNA 8 ul 10 mg ml-1 RNaseA (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon), tersini tüp birkaç kez karıştırın ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe 20 mg ml-1 proteinaz K (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon) ve tersini tüp birkaç kez ve inkübe 55 ° C karışımı 2 saat 4 ul ekle Kloroform: 400 ul fenol izoamil alkol (P: C: IA), girdap ve 2 ml Ağır Phaselock tüp (Eppendorf tarafından sağlanan yönergeleri izleyin) ile ayrı fazlar. P: C: IA çözüm eski veya düşük pH, degr olacakDNA mikroarray analiz geçerli hedeflerin tespiti ve zarar gürültü neden adation. 16 ul 5M NaCl (200 mM) son konsantrasyon) ve 1.5 20 μ ul ul-1 glikojen (30 mikrogram toplam) içeren yeni bir santrifüj tüpüne sulu tabaka transfer 800 ul EtOH ekleyin. -80 -20 ° C veya 30 dak ° C gece boyunca inkübe 10 dakika 20.000 g Spin 4 ° C pelet DNA. % 80 EtOH 500 ul ekleyerek tekrar süspansiyon pelet vorteks ve 4 az 5 dakika boyunca 20.000 g tekrar iplik ° C pelet yıkayın Kalan% 80 EtOH çıkarın. Kalan herhangi bir sıvı toplamak ve pelet kaçınarak, bir pipetteman sıvı kaldırmak için kısaca tüpler dönerler. Tüpler hava pelet sadece kuru hale gelene kadar kurumasını bekleyin: pelet hala nemli bir görünüm saklamalıdır. 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 70 ul her pelletini tekrar. Bu pelet saçınızın aşırı onları tekrar süspansiyon zor, ya da tüp yan uzak pul ve soyma sorumlu yapabilirsiniz. İsteğe Bağlı: 15 ul immunoprecipitation örnek ileride kullanmak üzere kaydedin. Bu malzeme mikroarray sonuçları gen-spesifik PCR onay gerçekleştirmek için kullanılır. (260 nm) UV absorpsiyon konsantrasyonu sayısal olarak. Not: kütüphane hazırlama ve amplifikasyon dNTP olmadan Sigma 10X Amp Mix modifiye GenomePLex WGA kiti kullanmak da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları izleyin: Kütüphane hazırlık Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. Arıtma DNA, PCR tüp Adım 11 1X Kütüphane Hazırlık Buffer 2 ul DNA örneği 10 ul ekleyin. Kütüphane Sabitleme Çözüm 1 ul ekleyin. ° C 2 dakika süreyle, santrifüj Vortex iyice pekiştirmek ve 95 termal cycler yer. Soğuk, buz üzerinde örnek santrifüj yoluyla santrifüj birleştirmek ve sonra buz dönmek. 1 Kütüphane Hazırlık Enzim ul iyice vorteks ve ardından kısa bir süre santrifüj ekleyin. Olarak termal cycler ve inkübe Yeri örnek aşağıdaki gibidir: 20 dakika boyunca 16 ° C 20 dakika boyunca 24 ° C 20 dakika boyunca 37 ° C 5 dakika boyunca 75 ° C 4 ° C tutun Termal cycler ve santrifüj kısaca örnekler çıkarın. Örnekler 20 ° C'de üç gün boyunca hemen amplifiye veya saklı olabilir. Amplifikasyon Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. Bir master karışımı aşağıda, Adım 3 ila 15 ul reaksiyon için aşağıdaki reaktifler ekleyerek hazırlanır: 10X Amp Mix 7.5 ul (dNTP olmadan) WGA DNA Polimeraz 5.0 ul 10 mM dNTP (her biri) hisse senedi (son konsantrasyonu 0.4 mM) 3.0 ul Nükleaz içermeyen su ile 75 ul son reaksiyon hacmi getir Iyice Vortex. Kısaca Santrifüj ve thermocycling başlamak. 3 dakika İlk Denatürasyon 95 ° C 14 döngüleri aşağıdaki gibi yapın: 15 saniye için bozulurak 94 ° C 65 uzatın / Tavlama ° C'de 5 dakika Bisiklet tamamlandıktan sonra, 4 reaksiyonlar korumak analiz veya arıtma için hazır olana kadar ° C veya -20 ° C'de saklayın. Quiagen üreticinin talimatlarına göre, PCR Arıtma ile DNA ® Kit arındırmak ve UV absorpsiyon (260 nm) konsantrasyonu ölçmek. Kütüphane Hazırlık amplifikasyon döngüsü tekrar yapın, aşağıdaki adaptasyonlar, Amplifikasyon, Adım 2 Adım 1 ile. • parçalanma sürecini başlatmak için yukarıdaki Adım 3, gerekli DNA miktarı ile ilgili olarak: DNA konsantrasyonu mg / ml, örnek 2.5 ul kullanın ve su ile son hacim 10 ul ayarlamak 200-300 civarındadır. DNA konsantrasyonu 50-60 mg / ml civarında ise, 5 ul örnek ve 10 ul son hacim su ile ayarlamak. • Bu ikinci büyütme işlemi, ana karışımı dTTPs ile dNTP, 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP ve 8 mM dTTP ve aynı konsantrasyonu önceki karışımı az 2 mM dUTP de dahil olmak üzere bir karışımı karşılığında. UV-vis spektrofotometre kullanarak ölçün DNA (260 nm). Normalde, daha fazla amplifiye DNA 9 mikrogram Her reaksiyon elde edilir. Not: DNA hedefleri etiketleme GeneChip ile yapılır ® Affymetrix WT Çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kit, üreticinin talimatlarına göre aşağıda açıklandığı gibi: Fragment amplifiye hedefleri Hedefin ne tür bir dizi bağlı olarak uygun aşağıdaki tabloyu kullanarak örnekleri Fragment hibrid olacakiçin randomize. Tablo 1. Tek diziler için Parçalanma Mix Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı Çift iplikli DNA 7.5 mikrogram 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul UDG, 10 U / ml 1.5 ul APE 1, 100 U / ml 2,25 ul 48 ul Nükleazlar ücretsiz su Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti Tablo 2. Çok dizi setleri için Parçalanma Mix Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı Çift iplikli DNA 9 mikrogram 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul UDG, 10 U / ml 1.5 ul APE 1, 100 U / ml 2,25 ul 48 Nükleazlar ücretsiz su Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti Yukarıdaki iki Tablolar göre parçalanma karışımı ayarlayın. Flick-mix ve tüpler aşağı döndürün. Inkübe reaksiyonlar: 1 saat boyunca 37 ° C 2 dakika süreyle 93 ° C. En az 2 dakika süreyle 4 ° C. Flick-mix, tüpler aşağı spin ve yeni bir tüp 45 ul örnek aktarmak. Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. Etiket parçalanmış çift iplikli DNA Aşağıdaki tabloda açıklandığı gibi çift iplikli DNA Etiketleme Mix hazırlayın: Tablo 3. Çift iplikli DNA Etiketleme Mix Bileşimi Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı 5X TdT Tampon 12 ul TdT 2 ul DNA Etiketleme Reaktif, 5 mM 1 ul Toplam hacmi 15 ul Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti DNA örnekleri, ti-mix, çift iplikli DNA Etiketleme Mix 15 ul ekleyin ve onları aşağı döndürün. Inkübe reaksiyonlar: 37 ° C – 60 dk. 10 dakika süreyle 70 ° C. 4 ° C en az 2 dk. Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. Gel-shift analizi % 4 agaroz jel hazırlayın. Fragment amplifiye hedefler, Adım 5 ve Etiket parçalanmış çift iplikli DNA, 65 Adım 4 ° C 'de 2 dakika süreyle örnekler inkübe edin. Ul Streptavidin (1 mg / ml), 10 ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe örnekleri ekleyin. Etiketleme ürünlerin shift göç kontrol etmek için% 4 agaroz jel Adım 3 (Jel-shift analizi, Adım 1) örnek çalıştırın. Dizi hibridizasyon & Dizi yıkama University of California Riverside Genomik Merkezi tarafından gerçekleştirilir. Dizi analizi Hesaplamalı analiz yapıldı. TAMPON KOMPOZİSYONLAR: Blok Çözüm: PBS +% 0,5 Bovine Serum Albumin (BSA). Lizis Tamponu: 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA % 1 Triton X-100 % 0.1 SDS 1mm PMSF Final pH 7.5 IP1: Lizis Tampon + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA % 0.5 'NP-40 % 0.5 Sodyum Dioxycholat Final pH 8.0 TE: 10 mM Tris, pH: 7.4 1 mM EDTA Final pH 8.0 Elüsyon Tampon: TE Tampon +% 1 SDS.