Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

Cellule ES scongelamento (Non in evidenza in video) Le cellule staminali sono congelati in terreno contenente il 10% di DMSO. Dal DMSO può indurre la differenziazione delle cellule staminali embrionali, può essere possibile scongelare le cellule alla fine della giornata e così di cambiare mezzo la mattina seguente per minimizzare gli effetti del DMSO residuo. Giacca a 6-ben cultura piastra tessuto con 0,1% di gelatina per almeno 15 minuti e aspirare immediatamente prima di cellule piatto su. Scongelare le cellule ES (circa 5 x 10 6 cellule, equivalente a un confluenti 6-bene) in un bagno d'acqua a 37 ° C e diluire in 10 ml di terreno preriscaldata cellule ES. Agglomerare le cellule facendo girare per 10 minuti a 1000 rpm in una centrifuga da banco clinica. Aspirare off medio e risospendere delicatamente le cellule in 10 ml di 37 ° C di media preriscaldata. Trasferimento sospensione cellulare al 6 pozzetti e di crescere a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. Cambia media il giorno seguente per rimuovere le cellule morte e DMSO residuo. Passaggio e l'espansione delle colture di cellule ES Le cellule staminali sono normalmente diversi passaggi ogni 2 / 3 giorni, e il mezzo viene cambiata a giorni alterni. Così, le cellule ES richiedono attenzione quotidiana. Nella nostra esperienza, alimentatore indipendente cellule ES crescere rapidamente e velocemente acidificare il mezzo, girando di giallo. Permettendo alle cellule di acidificare il mezzo (per non cambiare i media ogni giorno o da passaging le cellule troppo basso una diluizione) farà sì che le cellule a subire crisi, innescando eccesso di differenziazione e morte cellulare, dopo di che la loro totipotenza non può essere garantita. Cellule placcatura troppo basso una densità, dispersione insufficiente di cellule durante il passaggio, o placcatura irregolare potrebbero provocare problemi simili, come le cellule formeranno grumi grandi prima di raggiungere confluenza e le cellule all'interno di questi grumi si differenzieranno o morire. Germinale trasmissione è significativamente ridotta nelle cellule che sono stati maltrattati, anche quando appaiono sani al momento dell'iniezione. Per un confluenti 6 pozzetti di cellule aspirare media e lavare con 2-3 ml di 37 ° C preriscaldata PBS, pipettaggio lontano dalle cellule. Coprire le cellule con 1 ml di 1 × soluzione tripsina per 3-4 minuti o fino a quando le cellule sono uniformemente distribuiti in piccoli grumi. Aggiungere 1 ml di terreno per inattivare la tripsina. Raccogliere le cellule e le cellule trypsinized piastra (di solito 2 / 5 del bene) ad un fresco gelatinizzato 6 pozzetti. Cellule staminali congelamento Trypsinize uno confluenti 6 pozzetti (circa 1 × 10 7 cellule) come descritto sopra. Raccogliere le cellule trypsinized in 9 ml di terreno e di pellet per 5 minuti a 1.000 giri al minuto. Aspirare off medio e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di congelamento preparati al momento. Aliquota 0,5 ml di cellule in due cryotubes. Congelare le fiale a -80 ° C durante la notte e il trasferimento di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. ChIP-on-chip PROCEDURA Immunoprecipitazione Formaldeide cellule reticolazione (per cellule in sospensione) Utilizzare 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellule per immunoprecipitazione. Aggiungi formaldeide fresco per la sospensione cellulare a una concentrazione di 1%. Incuba le cellule con la soluzione di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il volume 1 / 10 di 1,25 M glicina per placare la formaldeide. Lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS 1x. Cellule piscina in 50 ml provette coniche e far girare a 700g per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere pellet in 1,5 ml di tampone di lisi. Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Flash-freeze tre celle volte in azoto liquido e utilizzare una smerigliatrice tessuto per rompere le cellule. Una volta che le cellule sono reticolati, possono essere conservati congelati a -80 ° C a tempo indeterminato. Preparazione sfere magnetiche (Steps sono tutti eseguiti a 4 ° C) Aggiungere 50 ml di perline Dynal a 1,5 ml microtubo ritenzione basso. Impostare 1 tubo di perle per immunoprecipitazione. Aggiungere 1 ml di soluzione di blocco. Raccogliere perle utilizzando Dynal MPC. Tubi posto in rack magnetico. Permettono di raccogliere perline sul lato del tubo. Questo dovrebbe durare circa 15 s. Inverti cremagliera due volte per aiutare a raccogliere le perle. Rimuovere il supernatante con pipettatore. Aggiungere 1 ml di soluzione di blocco e perline risospendere delicatamente nel rimuovere la striscia magnetica dal rack e invertendo il rack, con i tubi ancora al suo posto – sia 10-20 volte, o fino a quando le perle sono uniformemente risospendere. Raccogliere perle come sopra (punto 2). Rimuovere il supernatante con pipettatore. Lavare perline in 1,5 ml di soluzione di blocco, al punto 3, ancora una volta. Risospendere le sfere in 750 microlitri soluzione Block e aggiungere 10 mg di anticorpo. Incubare a 4 ° C per un minimo di 6 ore, o durante la notte, su un rotatore. Lavare perline tre tIME in 1 ml di soluzione di blocco, come descritto al punto 3. Cellula sonicazione Rimuovere pellet cellulare congelato da -80 ° C le cellule ed il trasferimento di tubi per sonicazione. Al momento preferisce utilizzare il fondo di una polupropylene standard, 15 ml di tubo conico per sonicazione. Abbiamo tagliato il tubo in due pezzi alla tacca dei 5 ml e scartare la parte superiore. Tubi possono essere coperto con parafilm o con il tappo del tubo durante l'impostazione. Utilizzando un rack provetta da microcentrifuga, tubo di posizione in modo sonicatore la sonda si trova a circa 0,5-1,0 cm sopra il fondo della provetta. Fare attenzione che la sonda è centrata e non contattare i lati del tubo. (Posizionamento della sonda può interessare se la soluzione di schiume o meno durante la sonicazione. In genere, la formazione di schiuma indica che il DNA sonicato sarà poco tosato.) Sonicare sospensione 6 volte durante 20 s. I campioni devono essere conservati in un bagno di acqua e di ghiaccio durante la sonicazione. Per diminuire la formazione di schiuma, inizialmente fissata potenza di uscita a 0 e aumentare manualmente al potere durante la prima sequenza finale. (Se vi sia una significativa formazione di schiuma, tutte le bolle possono essere rimossi mediante centrifugazione a 20.000 g seguita dalla risospensione delicato di tutto il materiale, senza lasciare bolle di schiuma.) Spin a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C a pellet e detriti raccolti il ​​surnatante in una provetta da 1,5 ml. Risparmia 50 ml di lisato cellulare di ogni campione di DNA come ingresso. Conservare a -20 ° C. Almeno una aliquota del DNA di ingresso deve essere mantenuto per lotto di lisato sonicare. Si noti che gli effetti degli effetti della sonicazione e la distribuzione risultante di dimensioni frammento può essere controllato solo dopo l'inversione reticolazione e purificazione del DNA. Immunoprecipitazione della cromatina Aggiungere la cromatina-equivalente pari al 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellule di sonicazione Cell, punto 4 al 50 microlitri anticorpo / magnetico mix tallone dalla preparazione sfere magnetiche, punto 6, con un volume finale di 1 ml (Può essere possibile regolare con Lysis Buffer, se non mai). Incubare per una notte il rotore a 4 ° C. Lavare Raccogliere perle utilizzando Dynal MPC. Tubi posto in rack. Permettono di raccogliere perline sul lato del tubo. Questo dovrebbe essere di circa 20 s. Inverti cremagliera due volte per aiutare a raccogliere tutte le perle. Rimuovere il supernatante con pipettatore, cambiando punte tra i campioni. Aggiungere 1 ml di Lysis Buffer in ciascuna provetta e perline risospendere delicatamente. Questo può essere fatto rimuovendo la striscia magnetica dal rack e invertendo il rack, con tubi ancora al suo posto – 10-20 volte o fino a quando le perle sono uniformemente risospeso. Raccogliere perle. Rimuovere il surnatante tramite pipetta. Ripetere questa lavare 5 volte di più, cambiando punte tra un lavaggio. Lavare perline 6 volte in 1 ml IP1 tampone, come descritto al punto 2. Lavare perline 6 volte in 1 ml di tampone IP2, come descritto al punto 2. Lavare perline 6 volte in 1 ml di TE 8,0 tampone, come descritto al punto 2. Spin a 960g per 3 minuti a 4 ° C e rimuovere eventuali residui di tampone TE. Eluizione Aggiungere 210 microlitri di tampone di eluizione e materiale eluiscano dalla perle incubando tubi in un bagno d'acqua a 65 ° C per 15 min. Vortex brevemente ogni 2 minuti. Questo incubazione può essere estesa fino a 30 minuti, che può contribuire a migliorare il recupero dell'eluato. Spin down perline a 16.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente. Prelevare 200 ml di surnatante e trasferimento al nuovo tubo. Il materiale può essere congelato a -20 ° C e conservato durante la notte. Crosslink inversione Reverse reticolare il DNA immunoprecipitazione da eluizione, Punto 3 di incubazione a 65 ° C per un minimo di 6 ore ad un massimo di 15 ore (più lunghi tempi di inversione di reticolazione di solito provocano un aumento dei disturbi per l'analisi microarray). Questo incubazione può essere fatta in un forno in modo che il tubo è riscaldato in modo uniforme e c'è meno condensa formata. Scongelare 50 ml di DNA ingresso riservato dopo sonicazione (Step 13), aggiungere 150 microlitri (3 volumi) di tampone di eluizione e mescolare. Reverse reticolazione questo DNA ingresso incubando a 65 ° C come in inversione Crosslink, Fase 1. Da questo punto, ogni tubo di immunoprecipitazione o DNA ingresso è considerato come un tubo separato o campione per la successiva elaborazione passi. Purificazione del DNA Aggiungere 8 ml di 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 ml concentrazione mg-1 finale), mescolare invertendo il tubo parecchie volte e incubare a 37 ° C per 2 ore Aggiungere 4 ml di 20 mg ml-1 proteinasi K (0,2 mg ml-1 concentrazione finale) e mescolare capovolgendo la provetta diverse volte e incubare a 55 ° C per 2 ore Aggiungere 400 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (P: C: IA), vortice e fasi distinte con 2 tubi pesanti Phaselock ml (seguire le istruzioni fornite da Eppendorf). Se il P: C: soluzione IA è vecchio o è a pH basso, ci sarà Degradation del DNA, causando rumore per l'analisi microarray e la perdita di rivelazione di bersagli validi. Trasferimento strato acquoso al tubo nuova centrifuga contenente 16 ml di NaCl 5M (200 mm) concentrazione finale) e 1,5 l di 20 microlitri μ-1 glicogeno (30 mg totali). Aggiungere 800 microlitri EtOH. Incubare per una notte a -20 ° C o 30 minuti a -80 ° C. Spin a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C a pellet di DNA. Lavare pellet aggiungendo 500 ml di EtOH 80%, vortex per risospendere pellet e filatura di nuovo a 20.000 g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere eventuali EtOH restante 80%. Gira la tubi leggermente per raccogliere eventuali residui di liquido e rimuovere il liquido con un pipetteman, evitando il pellet. Lasciate asciugare all'aria tubi fino a pellet sono solo secche: pellet dovrebbe comunque mantenere un aspetto umido. Risospendere ogni pellet in 70 ml di 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Secchino troppo di questi pellet può renderli difficili da riportare in sospensione, o rischia di sfaldarsi e staccarsi dal lato del tubo. Opzionale: Sconto del 15 l di campione immunoprecipitazione per un uso futuro. Questo materiale può essere usato per eseguire gene-specifico PCR conferma dei risultati di microarray. Quantificare la concentrazione di assorbimento UV (260 nm). NB: I passi seguenti compresa la preparazione biblioteca e amplificazione usare una versione modificata GenomePLex WGA kit con Mix Amp 10X da Sigma senza dNTP: Biblioteca preparazione Disponibili nel kit GenomePLex WGA con Mix Amp 10X da Sigma Aggiungere 2 ml di tampone 1X Biblioteca Preparazione a 10 ml di campione di DNA dal DNA Purificazione, Fase 11 in un tubo di PCR. Aggiungere 1 ml di soluzione di stabilizzazione Biblioteca. Vortex a fondo, consolidare per centrifugazione, e posto nel termociclatore a 95 ° C per 2 minuti. Raffreddare il campione in ghiaccio, consolidare mediante centrifugazione per centrifugazione, e poi tornare a ghiaccio. Aggiungere 1 ml di enzima Preparazione Biblioteca, vortice a fondo, quindi si centrifuga brevemente. Collocare il campione in un termociclatore e incubare come segue: 16 ° C per 20 minuti 24 ° C per 20 minuti 37 ° C per 20 minuti 75 ° C per 5 minuti 4 ° C tenere Rimuovere campioni di termociclatore e brevemente centrifuga. I campioni possono essere amplificati immediatamente o conservato a 20 ° C per tre giorni. Amplificazione Disponibili nel kit GenomePLex WGA con Mix Amp 10X da Sigma Un master mix è preparato aggiungendo i seguenti reagenti per la reazione di 15 microlitri dal Punto 3, qui di seguito: 7,5 ml di miscela Amp 10X (senza dNTP) 5,0 l di DNA polimerasi WGA 3,0 l di 10 mm dNTP (ciascuno) stock (concentrazione finale 0,4 mm) Portare il volume finale di reazione a 75 microlitri di acqua priva di nucleasi Vortex accuratamente. Centrifugare brevemente, e iniziare a ciclo termico. Denaturazione iniziale di 95 ° C per 3 minuti Eseguire 14 cicli come segue: Denaturare 94 ° C per 15 secondi Temprare / Estendere 65 ° C per 5 minuti Dopo il ciclo è completo, mantenere le reazioni a 4 ° C o conservare a -20 ° C fino al momento di analisi e purificazione. Purificare il DNA con PCR Purification Kit da Quiagen ® secondo le istruzioni del produttore e quantificare la concentrazione di assorbimento UV (260 nm). Eseguire di nuovo un ciclo di amplificazione da Preparazione Biblioteca, Passo da 1 a Amplificazione, Fase 2, con i seguenti adeguamenti. • Per quanto riguarda la quantità di DNA richiesto dal punto 3, di cui sopra, per avviare il processo di frammentazione: se la concentrazione di DNA è circa 200-300 mg / ml, utilizzare 2,5 ml di campione e regolare con acqua per un volume finale di 10 microlitri. Se la concentrazione di DNA è circa 50-60 mg / ml, usare 5 ml di campione e regolare con acqua per un volume finale di 10 microlitri. • In questo processo di amplificazione secondo dNTP con dTTPs per il mix master è cambio di un mix tra mM dATP 10, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP e 8 mm dTTP e 2 dUTP mM alla stessa concentrazione che il mix precedente. Misurare DNA utilizzando UV-vis spettrofotometro (260 nm). Normalmente, maggiore di 9 mg di DNA amplificato è ottenuto da ogni reazione. NB: L'etichettatura degli obiettivi del DNA viene eseguita con il GeneChip ® WT doppia elica del DNA Terminal Kit Etichettatura da Affymetrix secondo le istruzioni del produttore, come descritto di seguito: Obiettivi frammento amplificato Frammento i campioni utilizzando la tabella appropriata a seconda del tipo array l'obiettivo sarà ibridoIzed al. Tabella 1. Mix di frammentazione per gli array singolo Componente del volume / Importo in 1 RXN DNA a doppia elica 7,5 mcg La frammentazione del DNA 10X 4,8 microlitri UDG, 10 U / mL 1,5 microlitri APE 1, 100 U / mL 2,25 microlitri Acqua priva di nucleasi fino a 48 microlitri Disponibile nelle ® GeneChip WT doppia elica del DNA Kit Etichettatura Terminal da Affymetrix Tabella 2. Mix di frammentazione per il multi-array set Componente del volume / Importo in 1 RXN DNA a doppia elica 9 mcg La frammentazione del DNA 10X 4,8 microlitri UDG, 10 U / mL 1,5 microlitri APE 1, 100 U / mL 2,25 microlitri Acqua priva di nucleasi fino a 48 Disponibile nelle ® GeneChip WT doppia elica del DNA Kit Etichettatura Terminal da Affymetrix Impostare mix frammentazione in base ad una le tabelle di cui sopra. Flick-mix e spin giù i tubi. Incubare le reazioni: 37 ° C per 1 h. 93 ° C per 2 minuti. 4 ° C per almeno 2 minuti. Flick-mix, centrifugare i tubi, e trasferire 45 ml di campione in una nuova provetta. Rimuovere 2 ml di ogni campione per gel-shift analisi. Etichetta frammentato DNA a doppia elica Preparare la doppia elica del DNA Mix Etichettatura, come descritto nella tabella seguente: Tabella 3. Composizione del doppio filamento di DNA Mix Etichettatura Componente del volume / Importo in 1 RXN 5X TdT Buffer 12 microlitri TdT 2 microlitri DNA reagente Etichettatura, 5 mm 1 ml Totale volume 15 microlitri Disponibile nelle ® GeneChip WT doppia elica del DNA Kit Etichettatura Terminal da Affymetrix Aggiungere 15 microlitri della doppia elica del DNA Mix di etichettatura per i campioni di DNA, flick-mix, e spin giù. Incubare le reazioni: 37 ° C per 60 min. 70 ° C per 10 min. 4 ° C per almeno 2 minuti. Rimuovere 2 ml di ogni campione per gel-shift analisi. Gel-shift analisi Preparare un gel di agarosio 4%. Incubare i campioni dagli obiettivi frammento amplificato, Passo 5 e Label frammentato DNA a doppia elica, Fase 4 a 65 ° C per 2 minuti. Aggiungere 10 ml di Streptavidina (1 mg / ml) e incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 min. Esegui campioni provenienti da Fase 3 su un 4% gel (gel-shift analisi, punto 1) per controllare la migrazione spostamento della etichettatura dei prodotti. Array di ibridazione e di lavaggio Array Svolte dal Centro di genomica dell'Università di California, Riverside. Array di analisi Cantata da analisi computazionali. TAMPONE COMPOSIZIONI: Blocca Soluzione: PBS + 0,5% di sieroalbumina bovina (BSA). Lysis buffer 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,1% SDS 1 mM PMSF PH finale 7,5 IP1: Lysis Buffer + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mm LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 Dioxycholat sodio 0,5% PH finale 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7.4 1 mM EDTA PH finale 8,0 Eluizione buffer TE buffer + 1% SDS.