Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Ontdooien ES-cellen (niet in Featured Video) ES-cellen worden ingevroren in medium dat 10% DMSO. Omdat DMSO kan de differentiatie van ES-cellen te induceren, kan het mogelijk zijn om de cellen laat op de dag dooi en zo aan het medium te wijzigen de volgende ochtend om de effecten van de resterende DMSO te minimaliseren. Coat een 6-well weefselkweek plaat met 0,1% gelatine gedurende tenminste 15 minuten en onmiddellijk aspireer uit voordat op de plaat cellen op. Dooi ES-cellen (ongeveer 5 x 10 6 cellen, gelijk aan een samenvloeiende 6-well) in een 37 ° C waterbad en verdun tot 10 ml voorverwarmd ES-cel medium. Pellet van de cellen door het draaien van 10 minuten bij 1000 rpm in een bench-top klinische centrifuge. Aspireren uit middelgrote en voorzichtig resuspendeer cellen in 10 ml van 37 ° C voorverwarmd medium. Overdracht celsuspensie aan de 6-well plaat en groeien bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 incubator. Wijzig medium de volgende dag om de dode cellen en residuele DMSO te verwijderen. Passage en uitbreiding van de ES-cel-culturen ES-cellen worden routinematig gepasseerd om de 2 / 3 dagen, en het medium is veranderd op andere dagen. Dus, ES-cellen vereisen dagelijkse aandacht. In onze ervaring, feeder-onafhankelijke ES-cellen groeien snel en al snel verzuren het medium, draaien geel. Het toestaan ​​van de cellen naar de medium verzuren (door niet te veranderen in de media elke dag of door passage van de cellen op een te laag verdunning) zorgt ervoor dat de cellen crisis ondergaan, wat leidde tot teveel differentiatie en celdood, waarna hun totipotentie niet kan worden gegarandeerd. Plating cellen op een te lage dichtheid, onvoldoende spreiding van cellen tijdens de passage, of oneffen beplating kan leiden tot soortgelijke problemen, omdat de cellen grote klonters vormen voor het bereiken van samenloop en de cellen binnen deze groepjes wordt een onderscheid gemaakt of sterven. Kiembaan-transmissie is een aanzienlijk verminderd in cellen die zijn mishandeld, zelfs als ze gezond lijken op het moment van injectie. Voor een confluente 6-wells plaat van de cellen te zuigen medium af en was met 2-3 ml van 37 ° C voorverwarmde PBS, pipetteren uit de buurt van de cellen. Cover cellen met 1 ml van 1 × trypsine oplossing voor 3-4 minuten of tot de cellen zijn gelijkmatig verdeeld in kleine groepjes. Voeg 1 ml medium aan het trypsine te inactiveren. Verzamel getrypsiniseerd cellen en de plaat cellen (meestal 2 / 5 van goed) om een ​​vers gegelatiniseerd 6-well plaat. Invriezen ES-cellen Trypsinize een confluente 6-well plaat (ongeveer 1 × 10 7 cellen) zoals hierboven beschreven. Verzamel getrypsiniseerd cellen in 9 ml medium en pellet gedurende 5 minuten bij 1000 rpm. Aspireren uit middelgrote en resuspendeer celpellet in 1 ml vers bereide bevriezing medium. Aliquot 0,5 ml van de cellen in twee cryotubes. Bevries de flacons bij -80 ° C gedurende de nacht en over te dragen aan vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Chip-on-chip PROCEDURE Immunoprecipitatie Formaldehyde verknoping cellen (voor de opschorting cellen) Gebruik 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellen voor elk immunoprecipitatie. Voeg verse Formaldehyde aan de celsuspensie in een concentratie van 1%. Broedt cellen met formaldehyde-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 1 / 10 volume van 1,25 M glycine aan Formaldehyde lessen. Twee keer Spoel cellen met 10 ml 1x PBS. Zwembad cellen in 50 ml conische buizen en draaien op 700 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer pellet in 1,5 ml lysis buffer. Transfer cellen in een 1,5 ml microfugebuis. Flash-freeze drie keer cellen in vloeibare stikstof en het gebruik van een tissue slijpmachine om cellen te breken. Zodra cellen zijn verknoopt, kunnen ze worden bevroren opgeslagen bij -80 ° C voor onbepaalde tijd. Voorbereiden magnetische korrels (Steps zijn allemaal uitgevoerd bij 4 ° C) Voeg 50 ui van Dynal kralen tot 1,5 ml lage retentie microbuisjes. Stel een tube van kralen per immunoprecipitatie. Voeg 1 ml Block Solution. Verzamel kralen met behulp van Dynal MPC. Plaats de buisjes in magnetische rek. Laat kralen te verzamelen aan de zijkant van de buis. Dit duurt ongeveer 15 s. Twee keer omdraaien rack te helpen om parels te verzamelen. Verwijder supernatant met pipet. Voeg 1 ml Block Solution en voorzichtig resuspendeer kralen in het verwijderen van de magnetische strip uit het rek en omkeren van het rek met de buizen nog steeds op zijn plaats – ofwel 10-20 keer, of tot de kralen zijn gelijkmatig mengen. Verzamel parels als hierboven (stap 2). Verwijder supernatant met pipet. Was kralen in 1,5 ml Block Solution, zoals in stap 3, nog een keer. Resuspendeer kralen in 750 ul Block Solution en voeg 10 pg antilichaam. Incubeer bij 4 ° C voor een minimum van 6 uur, of 's nachts, op een rotator. Was de kralen drie tIMES in 1 ml Block Solution, zoals beschreven in stap 3. Cel ultrasoonapparaat Verwijder de bevroren celpellets van -80 ° C en overdracht cellen om buizen voor ultrasoonapparaat. We op dit moment de voorkeur aan de onderkant van een standaard polupropylene, 15 ml conische buis te gebruiken voor ultrasoonapparaat. Wij snijden de buis in twee stukken op de 5 ml-markering en gooi de bovenste helft. Buizen kunnen worden bedekt met parafilm of met het dopje tijdens het opzetten. Met behulp van een microfugebuis rek, positie buis, zodat de ultrasoonapparaat sonde zit ongeveer 0.5-1.0 cm boven de bodem van de buis. Zorg ervoor dat de sonde in het midden en heeft geen contact met de zijkanten van de buis. (Probe positionering kan invloed hebben op de vraag of de oplossing schuim of niet tijdens sonicatie. Typisch, schuimend geeft aan dat de gesoniceerd DNA zal slecht geschoren.) Ultrasone trillingen schorsing 6 keer gedurende 20 s. Monsters moeten worden bewaard in een ijs-waterbad tijdens de ultrasoonapparaat. Voor het verlagen van schuimvorming, aanvankelijk uitgangsvermogen op 0 en verhoging van de hand tot de uiteindelijke macht tijdens de eerste barsten. (Als er een aanzienlijke schuimende, kunnen alle bubbels worden verwijderd door centrifugatie bij 20.000 g gevolgd door een milde resuspensie van al het materiaal, waardoor er geen schuimbellen.) Spin bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet puin en oogst de bovenstaande vloeistof in een 1.5 ml buis. Bespaar 50 pi cellysaat van elk monster als input DNA. Bewaren bij -20 ° C. Ten minste een ingang DNA aliquot moeten worden gehouden per batch van ultrasone trillingen lysaat. Merk op dat de effecten van de effecten van de ultrasoonapparaat en de daaruit voortvloeiende verdeling van fragment maten kan worden gecontroleerd na het verknopen omkering en zuivering van DNA. Chromatine immunoprecipitatie Voeg de chromatine-equivalent bedrag van 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellen van Cell sonicatie, stap 4 op de 50 ul antilichaam / magnetische bead mix van voorbereiden magnetische korrels, Stap 6 met een eindvolume van 1 ml (Het kan worden mogelijk aan te passen met Lysis Buffer of nooit). Incubeer overnacht op rotator bij 4 ° C. Wassen Verzamel kralen met behulp van Dynal MPC. Plaats de buisjes in rack. Laat kralen te verzamelen aan de zijkant van de buis. Dit moet worden duurt ongeveer 20 s. Omgekeerde rack twee keer te helpen verzamelen van alle kralen. Verwijder supernatant met pipet, het veranderen van tips tussen de monsters. Voeg 1 ml Lysis Buffer aan elke buis en voorzichtig mengen kralen. Dit kan gedaan worden door het verwijderen van de magnetische strip uit het rek en omkeren van het rek met buisjes nog op zijn plaats – 10-20 keer of totdat de kralen zijn gelijkmatig geresuspendeerd. Verzamelen van kralen. Verwijder de bovenstaande vloeistof door de pipet. Herhaal dit vijf keer wassen, het veranderen van tips tussen de wasbeurten. Was kralen 6 keer in 1 ml buffer IP1, zoals beschreven in stap 2. Was kralen 6 keer in 1 ml buffer IP2, zoals beschreven in stap 2. Was kralen 6 keer in 1 ml TE 8.0 Buffer, zoals beschreven in stap 2. Spin bij 960g gedurende 3 min bij 4 ° C en verwijder de eventueel resterende TE-buffer. Elutie Voeg 210 ul van elutiebuffer en elueer materiaal van kralen door het incuberen van buizen in een 65 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Vortex kort om de 2 minuten. Deze incubatie kan worden verlengd zolang 30 min, die kan helpen bij het verbeteren herstel van het eluaat. Spin down kralen bij 16.000 g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder de 200 ul supernatant en transfer naar nieuwe buis. Materiaal kan worden ingevroren bij -20 ° C en 's nachts worden opgeslagen. Crosslink omkering Reverse crosslink de immunoprecipitatie DNA van Elutie, stap 3 door incubatie bij 65 ° C voor een minimum van 6 uur en een maximum van 15 uur (Langere tijden van verknopen omkering meestal leiden tot een verhoogde ruis in de microarray analyse). Deze incubatie kan gedaan worden in een oven, zodat de buis is gelijkmatig verwarmd en er ontstaat minder condensatie. Dooi 50 ul van de input-DNA gereserveerd nadat sonicatie (stap 13), voeg 150 ul (3 volumes) van elutiebuffer en meng. Reverse crosslink deze ingang DNA door incubatie bij 65 ° C als in Crosslink omkering, Stap 1. Vanaf dit punt wordt elke buis van immunoprecipitatie of input DNA beschouwd als een aparte buis of monster voor latere verwerking stappen. Zuivering DNA Voeg 8 pi van 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg ml-1 finale concentratie), meng door het buisje meerdere malen en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur Voeg 4 pl van 20 mg ml-1 proteïnase K (0,2 ug ml-1 finale concentratie) en meng door het buisje meerdere malen en incubeer bij 55 ° C gedurende 2 uur Voeg 400 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (P: C: IA), vortex en de afzonderlijke fasen met 2 ml Heavy Phaselock buis (volg de instructies van Eppendorf). Als de P: C: IA oplossing is oud is of bij een lage pH-waarde, zal er gradation van DNA, waardoor ruis in de microarray analyse en het verlies van de detectie van geldige doelen. Overdracht waterige laag om nieuwe centrifugebuis met 16 ul van 5M NaCl (200 mM) uiteindelijke concentratie) en 1,5 pl van 20 μ ul-1 glycogeen (30 ug totaal). Voeg 800 ul EtOH. Incubeer overnacht bij -20 ° C of 30 minuten bij -80 ° C. Spin bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet DNA. Was pellets door het toevoegen van 500 pi van 80% EtOH, vortexen te hersuspenderen pellet en spinnen weer bij 20.000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder eventuele resterende 80% EtOH. Kort draaien de buizen om alle resterende vloeistof op te vangen en de vloeistof te verwijderen met een pipetteman, het vermijden van de pellet. Laat buizen de lucht drogen tot pellets zijn net droog: pellets moet hebben nog steeds een vochtige uitstraling. Resuspendeer elke pellet in 70 ul van 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Uitdrogen van deze pellets kunnen ze moeilijk te mengen, of aansprakelijk te schilferen en schil weg van de kant van de buis. Optioneel: Bespaar 15 pi immunoprecipitatie monster voor toekomstig gebruik. Dit materiaal kan gebruikt worden om gen-specifieke PCR bevestiging van de microarray resultaten uit te voeren. Kwantificeren concentratie door UV-absorptie (260 nm). NB: De volgende stappen inclusief bibliotheek voorbereiding en versterking gebruik maken van een aangepaste GenomePLex WGA-kit met 10x Amp Mix van Sigma zonder dNTPs: Bibliotheek voorbereiding Verkrijgbaar in de GenomePLex WGA-kit met 10x Amp Mix van Sigma Voeg 2 pl 1X Bibliotheek Voorbereiding Buffer naar 10 ul van DNA-monster van de Zuivering DNA, Stap 11 in een PCR-buis. Voeg 1 ui van Bibliotheek Stabilization Solution. Vortex grondig te consolideren door centrifugeren, en plaats in de thermische cycler bij 95 ° C gedurende 2 minuten. Wordt het monster afgekoeld op ijs, te consolideren door middel van centrifugeren door centrifugeren, en dan terug naar ijs. Voeg 1 ui van Bibliotheek Voorbereiding Enzyme, vortex grondig, en vervolgens in het kort centrifuge. Plaats het monster in een thermal cycler en incubeer als volgt: 16 ° C gedurende 20 minuten 24 ° C gedurende 20 minuten 37 ° C gedurende 20 minuten 75 ° C gedurende 5 minuten 4 ° C te houden Verwijder de monsters van thermal cycler en centrifugeer kort. Monsters mogen onmiddellijk worden versterkt of bewaard bij 20 ° C gedurende drie dagen. Versterking Verkrijgbaar in de GenomePLex WGA-kit met 10x Amp Mix van Sigma Een meester mix wordt bereid door toevoeging van de volgende reagentia om de 15 ul reactie van stap 3, onder: 7,5 pi van 10X Amp Mix (zonder dNTPs) 5,0 pi van WGA DNA Polymerase 3,0 pi van een 10 mM dNTP (elk) voorraad (eindconcentratie 0,4 mm) Breng laatste reactie volume tot 75 ul met nuclease-vrij water Vortex grondig. Centrifuge kort, en beginnen thermocycling. Initiële denaturatie 95 ° C gedurende 3 minuten Voer 14 cycli als volgt: Denatureren 94 ° C gedurende 15 seconden Gloeien / Extend 65 ° C gedurende 5 minuten Na het fietsen is voltooid, blijven de reacties bij 4 ° C of bewaar bij -20 ° C tot klaar voor analyse of zuivering. Zuiveren het DNA met PCR Purification Kit ® van Quiagen volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeren van concentratie door UV-absorptie (260 nm). Voer opnieuw een cyclus van versterking van de Bibliotheek Voorbereiding, Stap 1 tot en met Amplification, stap 2, met de volgende aanpassingen. • Wat betreft de benodigde hoeveelheid DNA van Stap 3, boven, aan de versnippering proces te starten: Als de concentratie van het DNA is ongeveer 200-300 ug / ml, 2,5 ul van het monster te gebruiken en aan te passen met water voor een eindvolume van 10 pi. Als de concentratie van het DNA is rond de 50-60 ug / ml, gebruik 5 ul van het monster en aan te passen met water voor een eindvolume van 10 pi. • In dit tweede versterking proces, dNTPs met dTTPs voor de master mix is ​​ruil voor een mix met 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP en 8 mm dTTP en 2 mM dUTP bij dezelfde concentratie dat de vorige mix. Meten met behulp van DNA UV-vis spectrofotometer (260 nm). Normaal gesproken, is groter dan 9 ug van geamplificeerd DNA verkregen uit elke reactie. NB: De etikettering van de DNA-doelstellingen is uitgevoerd met de GeneChip ® WT double-stranded DNA Terminal Etikettering Kit van Affymetrix volgens de instructies van de fabrikant, zoals hieronder beschreven: Fragment versterkt doelen Fragment van de monsters met behulp van de juiste tabel hieronder, afhankelijk van welk type Array het streefcijfer zal worden hybrideseerd aan. Tabel 1. Versnippering Mix voor enkele arrays Component Volume / Bedrag in een Rxn Dubbelstrengs DNA 7,5 microgram 10X cDNA Fragmentatie 4,8 pl UDG, 10 U / ul 1,5 ul APE 1, 100 U / ul 2,25 ul Nuclease-vrij water tot 48 ui Verkrijgbaar in de GeneChip ® WT double-stranded DNA Terminal Etikettering Kit van Affymetrix Tabel 2. Versnippering Mix voor multi-array sets Component Volume / Bedrag in een Rxn Dubbelstrengs DNA 9 microgram 10X cDNA Fragmentatie 4,8 pl UDG, 10 U / ul 1,5 ul APE 1, 100 U / ul 2,25 ul Nuclease-vrij water tot 48 Verkrijgbaar in de GeneChip ® WT double-stranded DNA Terminal Etikettering Kit van Affymetrix Stel fragmentatie mix volgens een tabel hierboven. Flick-mix en spin down van de buizen. Incubeer de reacties op: 37 ° C gedurende 1 uur 93 ° C gedurende 2 minuten. 4 ° C gedurende ten minste 2 minuten. Flick-mix, spin down de buizen, en overdracht 45 ul van het monster naar een nieuwe buis. Verwijder 2 pi van elk monster voor gel-shift-analyse. Label gefragmenteerde dubbelstrengs DNA Bereid de double-stranded DNA Etikettering Mix zoals beschreven in de onderstaande tabel: Tabel 3. Samenstelling van de double-stranded DNA Labelling Mix Component Volume / Bedrag in een Rxn 5X TdT Buffer 12 ul TdT 2 pi DNA Etikettering reagens, 5 mm 1 ui Totale volume 15 ul Verkrijgbaar in de GeneChip ® WT double-stranded DNA Terminal Etikettering Kit van Affymetrix Voeg 15 ul van de double-stranded DNA Etikettering Mix aan de DNA-monsters, flick-mix, en spin ze naar beneden. Incubeer de reacties op: 37 ° C gedurende 60 minuten. 70 ° C gedurende 10 minuten. 4 ° C gedurende ten minste twee minuten. Verwijder 2 pi van elk monster voor gel-shift-analyse. Gel-shift-analyse Bereid een 4% agarose gel. Incubeer monsters van Fragment versterkt targets, Stap 5 en Label gefragmenteerde dubbelstrengs DNA, Stap 4 bij 65 ° C gedurende 2 minuten. Voeg 10 ul van Streptavidine (1 mg / ml), en incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Lopen monsters van stap 3 op een 4% agarose gel (Gel-shift-analyse, stap 1) de verschuiving migratie van de etikettering van producten te controleren. Array hybridisatie & Array wassen Uitgevoerd door de Genomic Center van de University of California Riverside. Array analyse Uitgevoerd door computationele analyse. BUFFER COMPOSITIES: Block Oplossing: PBS + 0,5% Bovine Serum Albumine (BSA). Lysis Buffer: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,1% SDS 1 mM PMSF Eind pH 7,5 IP1: Lysis Buffer + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 0,5% Natrium Dioxycholat Eind pH 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA Eind pH 8,0 Elutiebuffer: TE-buffer + 1% SDS.