Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Les cellules ES Décongélation (ne figure pas dans la vidéo) Les cellules ES sont congelés dans un milieu contenant 10% de DMSO. Depuis le DMSO peut induire la différenciation des cellules ES, il peut être possible de dégel, les cellules en fin de journée et ainsi de changer le milieu, le lendemain matin afin de minimiser les effets du DMSO résiduel. Enduire une plaque de 6 puits de culture tissulaire avec 0,1% de gélatine pendant au moins 15 min et aspirer immédiatement avant de cellules de la plaque sur le. Décongelez les cellules ES (environ 5 × 10 6 cellules, équivalent à une confluence de 6 puits) dans un bain d'eau à 37 ° C et diluer dans 10 ml de milieu cellules ES préchauffée. Pellet les cellules en faisant tourner pendant 10 minutes à 1000 rpm dans une centrifugeuse de paillasse clinique. Aspirer délicatement les cellules moyennes et remettre en suspension dans 10 ml de 37 ° C moyenne préchauffée. Suspension de cellules de transfert à la plaque de 6 puits et de croître à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 incubateur. Changement moyen le lendemain pour enlever les cellules mortes et le DMSO résiduel. Passage et l'expansion des cultures de cellules ES Les cellules ES sont régulièrement repiquées tous les 2 / 3 jours, et le milieu est changé tous les deux jours. Ainsi, les cellules ES requièrent une attention quotidienne. Dans notre expérience, chargeur indépendant cellules ES croître rapidement et rapidement acidifier le milieu, tournant dans le jaune. Permettant aux cellules d'acidifier le milieu (en ne changeant pas les médias tous les jours ou par passage des cellules à trop basse dilution) va provoquer des cellules de subir la crise, déclenchant une différenciation excessive et la mort des cellules, après quoi leur totipotence ne peut être garantie. Cellules de placage à une densité trop faible, la dispersion insuffisante des cellules au cours du passage, ou le placage inégale peut causer des problèmes similaires, comme les cellules vont former des amas de grandes avant d'atteindre la confluence et des cellules au sein de ces touffes se différencier ou mourir. Germinale de transmission est significativement réduite dans une des cellules qui ont été maltraités, même quand ils semblent en bonne santé au moment de l'injection. Pour une confluence de 6 puits plaque de cellules ponction moyenne et laver avec 2-3 ml de 37 ° C PBS préchauffé, il pipetage loin des cellules. Couvrir les cellules avec 1 ml d'une solution de trypsine × pendant 3-4 minutes ou jusqu'à ce que les cellules sont uniformément dispersés dans de petites touffes. Ajouter 1 ml de milieu pour inactiver la trypsine. Recueillir les cellules trypsinisées et cellules de la plaque (en général 2 / 5 de bien) à un fraîchement gélatinisé 6-même assiette. Les cellules ES de congélation Trypsiniser une confluence de 6 puits plaque (environ 1 × 10 7 cellules), comme décrit ci-dessus. Recueillir les cellules trypsinisées dans 9 ml de milieu et de culot pendant 5 minutes à 1000 rpm. Aspirer moyen et cellulaire resuspendre le culot dans 1 ml de milieu de congélation fraîchement préparés. Aliquote de 0,5 ml de cellules en deux cryotubes. Congelez les flacons à -80 ° C pendant la nuit et transfert à l'azote liquide pour stockage à long terme. ChIP-on-chip PROCÉDURE Immunoprécipitation Cellules réticulation formaldéhyde (pour cellules en suspension) Utilisez 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellules pour chaque immunoprécipitation. Ajouter formaldéhyde frais à la suspension cellulaire à une concentration de 1%. Incube les cellules avec la solution de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter 1 / 10 volume de 1,25 M de glycine pour étancher formaldéhyde. Rincer les cellules deux fois avec 10 ml de PBS 1x. Piscine cellules dans 50 ml tubes coniques et centrifuger à 700g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de tampon de lyse. Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml. Flash-gel de trois cellules reprises dans l'azote liquide et d'utiliser un broyeur de tissus pour briser les cellules. Une fois que les cellules sont réticulés, ils peuvent être conservés congelés à -80 ° C indéfiniment. Préparation des billes magnétiques (étapes sont toutes réalisées à 4 ° C) Ajouter 50 ul de billes Dynal à 1,5 ml microtubes de rétention faibles. Mettre en place 1 tube de perles par immunoprécipitation. Ajouter une solution de bloc ml. Recueillir des perles Dynal MPC aide. Placer les tubes dans le rack magnétique. Autoriser des perles à recueillir sur le côté du tube. Cela devrait prendre environ 15 s. Inverser la porte à deux reprises pour aider à recueillir des perles. Retirer le surnageant avec pipette. Ajouter 1 ml de solution bloc et perles délicatement enlever remettre en suspension dans la bande magnétique de la grille et en inversant le rack, avec les tubes encore en place – soit 10-20 fois, ou jusqu'à ce que les perles sont une suspension uniforme. Recueillir des perles comme ci-dessus (étape 2). Retirer le surnageant avec pipette. Lavez perles dans 1,5 ml de solution bloc, comme dans l'étape 3, une fois de plus. Remettre les billes en 750 Solution bloc ul et ajouter 10 ug d'anticorps. Incuber à 4 ° C pendant un minimum de 6h, ou toute la nuit, sur un rotateur. Lavez perles trois times dans une solution de bloc ml, comme décrit dans l'étape 3. Sonication cellulaire Retirer culots cellulaires congelés entre -80 C et le transfert de cellules ° à tubes pour sonication. Nous avons actuellement préfèrent utiliser le fond d'un polupropylene standard, tube de 15 ml conique pour sonication. Nous avons coupé le tube en deux morceaux à la marque de 5 ml et jeter la moitié supérieure. Les tubes peuvent être recouverts de parafilm ou avec le bouchon du tube lors de la configuration. Utilisation d'un rack tube de centrifugeuse, le tube de position afin de la sonde se trouve à environ 0.5 à 1.0 sonicateur cm au dessus du fond du tube. Veillez à ce que la sonde est centrée et ne contacte pas les côtés du tube. (Positionnement de la sonde peuvent affecter que les mousses solution ou non pendant la sonication. Typiquement, le moussage indique que l'ADN soniqué sera mal rasé.) Soniquer suspension de six fois pendant 20 s. Les échantillons doivent être conservés dans un bain d'eau glacée pendant la sonication. Pour diminuer le moussage, initialement fixé puissance de sortie à 0 et augmenter manuellement la puissance finale au cours de première rafale. (S'il n'y est significatif moussant, toutes les bulles peuvent être éliminés par centrifugation à 20.000 g suivie de la remise en suspension douce de tout le matériel, ne laissant aucune bulles de la mousse.) Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C à granulés de débris et de récolter le surnageant dans un tube de 1,5 ml. Économisez 50 ul de lysat cellulaire de chaque échantillon de l'ADN d'entrée. Conserver à -20 ° C. Au moins une partie aliquote d'ADN d'entrée doivent être conservés par lot de lysat soniquer. Notez que les effets des effets de la sonication et la distribution de tailles de fragments résultant ne peuvent être vérifiés après le renversement réticulent et la purification de l'ADN. Immunoprécipitation de la chromatine Ajouter la quantité de la chromatine équivalent de 5 x 10 7 – 1 x 10 8 cellules par sonication cellulaire, étape 4 pour les 50 ul d'anticorps / mélange de billes magnétiques de la préparation des billes magnétiques, étape 6 avec un volume final de 1 ml (Il peut être possible d'ajuster avec le tampon de lyse, si jamais). Incuber une nuit sur les rotateurs à 4 ° C. Laver Recueillir des perles Dynal MPC aide. Placer les tubes dans le rack. Autoriser des perles à recueillir sur le côté du tube. Cela devrait être de prendre environ 20 s. Inverser la porte à deux reprises pour aider à recueillir toutes les billes. Retirer le surnageant avec pipette, en changeant des conseils entre les échantillons. Ajouter 1 ml de tampon de lyse dans chaque tube et perles délicatement resuspendre. Cela peut être fait en retirant la bande magnétique de la grille et en inversant la grille, avec des tubes encore en place – 10-20 fois ou jusqu'à ce que les billes sont remises en suspension homogène. Recueillir des perles. Retirer le surnageant par pipetage. Répéter ce lavage 5 fois plus, en changeant des conseils entre les lavages. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de tampon IP1, comme décrit dans l'étape 2. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de tampon IP2, comme décrit dans l'étape 2. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de TE Buffer 8.0, comme décrit dans l'étape 2. Centrifuger à 960 g pendant 3 min à 4 ° C et enlever tout résidu de tampon TE. Élution Ajouter ul 210 de tampon d'élution et le matériel éluer à partir de perles en incubant les tubes dans un bain d'eau à 65 ° C pendant 15 min. Vortex brièvement toutes les 2 min. Cette incubation peut être prolongée aussi longtemps que 30 minutes, ce qui peut aider à améliorer la récupération de l'éluat. Isoler perles à 16.000 g pendant 1 min à température ambiante. Retirer 200 pl de surnageant et transférer dans un nouveau tube. Le matériel peut être congelé à -20 ° C et stockée pendant la nuit. Inversion Crosslink Réticulent inverse de l'ADN à partir d'élution immunoprécipitation, l'étape 3 par incubation à 65 ° C pendant un minimum de 6 h et un maximum de 15 h (temps plus longs de l'inversion réticulent entraînent généralement une augmentation du bruit dans l'analyse des microréseaux). Cette incubation peut être fait dans un four afin que le tube est chauffé uniformément et il ya moins de condensation formées. Dégeler 50 pl de l'ADN d'entrée réservée après sonication (étape 13), ajouter 150 ul (3 volumes) de tampon d'élution et mélanger. Inverse réticulent cet ADN d'entrée en incubant à 65 ° C comme inversion Crosslink, l'étape 1. De ce point, tous les tubes d'immunoprécipitation ou de l'ADN d'entrée est considéré comme un tube séparé ou d'un échantillon pour un traitement ultérieur étapes. DNA Purification Ajouter 8 ul de 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg de concentration ml-1 final), mélanger en inversant le tube fois plusieurs et incuber à 37 ° C pendant 2 h. Ajouter 4 pi de 20 mg ml-1 protéinase K (0,2 pg ml-1 concentration finale) et mélanger en retournant le tube plusieurs fois et incuber à 55 ° C pendant 2 h. Ajouter 400 ul de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (P: C: IA), vortex et phases distinctes avec 2 ml Phaselock tubes lourds (suivre les instructions fournies par Eppendorf). Si le P: C: solution IA est ancienne ou à faible pH, il y aura degradation de l'ADN, provoquant du bruit dans l'analyse de puces à ADN et la perte de détection de cibles valides. Transfert couche aqueuse à tube à centrifuger contenant 16 nouvelles ul de NaCl 5M (200 mM) en concentration finale) et 1,5 l de 20 μ ul-1 glycogène (30 au total pg). Ajouter 800 ul EtOH. Incuber pendant la nuit à -20 ° C ou 30 min à -80 ° C. Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C à culot d'ADN. Lavez boulettes en ajoutant 500 ul d'EtOH 80%, vortex pour resuspendre granulés et la filature à nouveau à 20000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez tout EtOH 80% restants. Faites tourner les tubes brièvement pour ramasser tout liquide restant et enlever le liquide avec une pipetteman, en évitant le culot. Laisser l'air sec jusqu'à des tubes granules sont à peine secs: pellets doit toujours conserver un aspect humide. Resuspendre chaque pastille dans 70 ul de 10 mM Tris-HCI, pH 8,0. Surséchage de ces pastilles peuvent les rendre difficiles à remettre en suspension, ou susceptibles d'en flocons et de décoller du côté du tube. En option: Enregistrer 15 ul d'échantillon immunoprécipitation pour une utilisation future. Ce matériau peut être utilisé pour effectuer des gènes spécifiques de confirmation des résultats de la PCR biopuces. Quantifier la concentration par absorption UV (260 nm). NB: Les étapes suivantes, y compris la préparation de bibliothèques et de l'amplification d'utiliser un kit de modification GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de Sigma, sans dNTPs: Préparation de la Bibliothèque Disponible dans le kit GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de chez Sigma Ajouter 2 ul de tampon 1X Préparation Bibliothèque à 10 ul d'échantillon d'ADN de l'ADN Purification, étape 11 dans un tube PCR. Ajouter 1 ml de solution de stabilisation de la bibliothèque. Vortex à fond, de consolider par centrifugation, et les placer dans le thermocycleur à 95 ° C pendant 2 minutes. Refroidir l'échantillon sur la glace, de consolider par centrifugation par centrifugation, puis retour à la glace. Ajouter 1 pl de préparation enzymatique Bibliothèque, vortex soigneusement, puis centrifuger brièvement. Placer l'échantillon dans un cycleur thermique et incuber comme suit: 16 ° C pendant 20 minutes 24 ° C pendant 20 minutes 37 ° C pendant 20 minutes 75 ° C pendant 5 minutes 4 ° C détiennent Retirer les échantillons de thermocycleur et centrifuger brièvement. Les échantillons peuvent être amplifiés immédiatement ou conservés à 20 ° C pendant trois jours. D'amplification Disponible dans le kit GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de chez Sigma Un mélange maître est préparé en ajoutant les réactifs suivants à la réaction 15 pl de l'étape 3, ci-dessous: 7,5 l de Mix Amp 10X (sans dNTP) 5,0 l de WGA ADN polymérase 3,0 pi d'un dNTP 10 mM (chacun) stock (concentration finale 0,4 mM) Amener le volume final de réaction de 75 ul avec une eau sans nucléase Vortex à fond. Centrifuger brièvement, et de commencer thermocyclage. Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 minutes Effectuer 14 cycles comme suit: Dénaturer 94 ° C pendant 15 secondes Recuit / Étendre 65 ° C pendant 5 minutes Après le cyclisme est complète, de maintenir les réactions à 4 ° C ou conserver à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse ou la purification. Purifier l'ADN avec PCR Purification Kit ® de Quiagen conformément aux instructions du fabricant et de quantifier la concentration par absorption UV (260 nm). Effectuer à nouveau un cycle d'amplification de la Préparation Bibliothèque, étape 1 à l'amplification, l'étape 2, avec les adaptations suivantes. • Concernant la quantité d'ADN nécessaire à l'étape 3, ci-dessus, d'engager le processus de fragmentation: Si la concentration d'ADN est d'environ 200-300 pg / ml, utiliser 2,5 l de l'échantillon et ajuster avec de l'eau pour un volume final de 10 pl. Si la concentration d'ADN est environ 50-60 pg / ml, utiliser 5 ul d'échantillon et ajuster avec de l'eau pour un volume final de 10 pl. • Dans ce processus d'amplification seconde, avec des dNTP dTTPs pour le mélange maître est l'échange d'un mélange comprenant 10 mM, 10 mM de dATP dGTP, dCTP et 10 mM dTTP 8 mM et 2 mM dUTP à la même concentration que le mélange précédent. Mesurer l'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV-visible (260 nm). Normalement, plus de 9 pg d'ADN amplifié est obtenu à partir de chaque réaction. NB: Le marquage des cibles ADN est effectué avec le GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal selon les instructions du fabricant, comme décrit ci-dessous: Cibles fragment amplifié Fragment les échantillons en utilisant le tableau approprié ci-dessous en fonction de ce type array, la cible sera hybrideindustrialisés d'. Tableau 1. Mélanger la fragmentation des réseaux uniques Volume Composant / Montant dans une Rxn ADN double brin 7,5 pg 10X fragmentation ADNc 4,8 ul UDG, 10 U / pl 1,5 pl APE 1, 100 U / ul ul 2,25 Eau sans nucléase jusqu'à 48 ul Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal Tableau 2. Mélanger la fragmentation pour le multi-ensemble fixe Volume Composant / Montant dans une Rxn ADN double-brin 9 pg 10X fragmentation ADNc 4,8 ul UDG, 10 U / pl 1,5 pl APE 1, 100 U / ul ul 2,25 Eau sans nucléase jusqu'à 48 Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal Mettre en place mélangez la fragmentation selon les tableaux ci-dessus soit. Flick-mix et spin bas des tubes. Incuber les réactions à l'adresse: 37 ° C pendant 1 h. 93 ° C pendant 2 min. 4 ° C pendant au moins 2 minutes. Flick-mix, ralentit les tubes, et le transfert 45 pl de l'échantillon dans un nouveau tube. Retirer 2 ul de chaque échantillon pour l'analyse de gel changement. Étiquette fragmenté ADN double-brin Préparer le mélange d'ADN double brin étiquetage tel que décrit dans le tableau ci-dessous: Tableau 3. Composition du double brin d'ADN Mix étiquetage Volume Composant / Montant dans une Rxn 5X tampon TdT 12 ul TdT 2 pl Réactif étiquetage ADN, 5 mM 1 pl Le volume total 15 pi Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal Ajouter 15 ul du Mix ADN double-brin d'étiquetage pour les échantillons d'ADN, feuilletez-mix, et les spin-down. Incuber les réactions à l'adresse: 37 ° C pendant 60 min. 70 ° C pendant 10 min. 4 ° C pendant au moins 2 min. Retirer 2 ul de chaque échantillon pour l'analyse de gel changement. Gel-analyse de changement Préparer un gel agarose à 4%. Incuber les échantillons à partir des cibles fragment amplifié, étape 5 et Label fragmenté ADN double-brin, étape 4 à 65 ° C pendant 2 min. Ajouter 10 ul de streptavidine (1 mg / ml), et des échantillons incuber à température ambiante pendant 5 min. Exécuter des échantillons provenant de l'étape 3 sur une 4% de gel d'agarose (Gel-Shift analyse, étape 1) pour vérifier la migration déplacement des produits d'étiquetage. L'hybridation tableau & tableau à laver Interprété par le Centre de génomique de l'Université de Californie Riverside. Analyse tableau Interprété par l'analyse informatique. Compositions de tampon: Bloc Solution: PBS + 0,5% albumine sérique bovine (BSA). Tampon de lyse: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM de NaCl EDTA 1 mM 1% de Triton X-100 SDS 0,1% 1mM de PMSF Le pH final 7,5 IP1: Lysis Buffer + 500 mM de NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM de LiCl EDTA 1 mM 0,5% de NP-40 Dioxycholat sodium à 0,5% Le pH final 8,0 TE: Tris 10 mM, pH 7,4 EDTA 1 mM Le pH final 8,0 Tampon d'élution: tampon TE + 1% de SDS.