Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Descongelamento células ES (Não representados em Vídeo) Células-tronco embrionárias são congelados em meio contendo DMSO 10%. Desde DMSO pode induzir a diferenciação de células-tronco embrionárias, pode ser possível para descongelar as células no final do dia e assim mudar o meio da manhã seguinte para minimizar os efeitos do DMSO residual. Um casaco bem 6-placa de cultura de tecidos com 0,1% de gelatina por pelo menos 15 min e aspirar imediatamente antes de as células da placa. Descongele as células ES (cerca de 5 × 10 6 células, o equivalente a um confluentes 6-bem) em um banho de água 37 ° C e diluir em 10 ml de meio de pré-aquecida ES celular. Agregar as células girando por 10 minutos a 1000 rpm em uma centrífuga de bancada clínico. Aspirar off médio e células delicadamente ressuspender em 10 ml de 37 ° C médio pré-aquecido. Suspensão de transferência de célula para a placa de 6 poços e crescer a 37 ° C em 5% umidificado incubadora de CO 2. Mudança média no dia seguinte para remover células mortas e DMSO residual. Passagem e expansão de culturas de células ES Células-tronco embrionárias são rotineiramente várias passagens a cada 03/02 dias, eo meio é alterado em dias alternados. Assim, as células ES requerem atenção diária. Em nossa experiência, alimentador independente de células ES crescer rapidamente e rapidamente acidificar o meio, transformando-amarelo. Permitindo que as células para acidificar o meio (não mudando a mídia todos os dias ou pelo passaging as células em muito baixa diluição a) fará com que as células se submeter a crise, provocando excesso de diferenciação e morte celular, após a qual sua totipotência não pode ser garantido. Células no revestimento de muito baixa densidade de um, a dispersão insuficiente de células durante a passagem, ou revestimento irregular pode causar problemas semelhantes, como as células irão formar grandes aglomerações antes de chegar a confluência e as células dentro desses aglomerados irá diferenciar ou morrer. Germinativas transmissão é significativamente reduzida em células que têm sido maltratados, mesmo quando parecem saudáveis ​​no momento da injeção. Por um prato de 6 bem confluentes de células de aspirado de médio e lave com 2-3 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS, pipetagem fora das células. Cobrir as células com 1 ml de 1 × solução de tripsina por 3-4 minutos ou até que as células são uniformemente dispersos em pequenos aglomerados. Adicionar 1 ml de meio para a inativação da tripsina. Coletar células e as células tripsinizados placa (geralmente 2 / 5 do bem) para um recém-gelatinizado placa de 6 poços. Congelamento de células ES Trypsinize um prato 6-bem confluentes (cerca de 1 × 10 7 células), como descrito acima. Coletar células tripsinizados em 9 ml de meio e de pelotas por 5 minutos a 1.000 rpm. Aspirar off médio e ressuspender célula sedimento em 1 ml de meio de congelamento preparados na hora. Alíquota de 0,5 ml de células em duas criotubos. Congelar os frascos a -80 ° C durante a noite e transferência para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Chip-on-chip PROCEDIMENTO Imunoprecipitação Formaldeído células crosslinking (para células em suspensão) Use 5 x 10 7 – 1 x 10 8 células para cada imunoprecipitação. Adicionar formaldeído fresco para a suspensão de células a uma concentração de 1%. Incuba células com solução de formaldeído por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicionar volume 1 / 10 de 1,25 M de glicina para saciar formaldeído. Lave as células duas vezes com 10 ml de PBS 1x. Células piscina em 50 ml tubos cônicos e giram em 700g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1,5 ml de Tampão de Lise. Transferência de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Flash-congelamento de três vezes as células em nitrogênio líquido e use um moedor de tecido para quebrar as células. Uma vez que as células são reticuladas, podem ser armazenadas congeladas a -80 ° C por tempo indeterminado. Preparando esferas magnéticas (Passos são todos realizados a 4 ° C) Adicionar 50 ul de contas Dynal a 1,5 ml microtubo de retenção baixa. Configurar um tubo de contas por imunoprecipitação. Adicionar 1 ml da solução de bloco. Coletar contas usando Dynal MPC. Colocar os tubos em rack magnético. Permitir que contas de recolher no lado do tubo. Isso deve levar cerca de 15 s. Inverter rack de duas vezes para ajudar a coletar as esferas. Remover o sobrenadante com pipeta. Adicionar 1 ml da solução de bloco e contas delicadamente ressuspender na remoção da tira magnética do rack e rack invertendo a, com os tubos ainda no lugar – ou 10-20 vezes, ou até que as contas estão uniformemente ressuspender. Coletar pérolas como acima (Passo 2). Remover o sobrenadante com pipeta. Lavar contas em 1,5 ml da solução de bloco, como no Passo 3, mais uma vez. Ressuspender contas em 750 mL da solução de bloco e adicionar 10 mg de anticorpos. Incubar a 4 ° C por um mínimo de 6h, ou durante a noite, em um rotador. Lavar três esferas de times em uma solução de Bloco ml, conforme descrito na Etapa 3. Sonicação de células Remover pellets de células congeladas de -80 ° C células e transferência para tubos de sonicação. Atualmente, preferimos usar o fundo de um polupropylene padrão, 15 ml tubo cônico para sonicação. Nós cortamos o tubo em duas partes na 5 ml marca e descartar a metade superior. Tubos podem ser cobertos com parafilme ou com a tampa do tubo durante a configuração. Usando um rack de tubo de microcentrífuga, tubo de posição para que a sonda sonicador senta aproximadamente 0,5-1,0 cm acima do fundo do tubo. Tome cuidado para que a sonda está centrada e não contactar os lados do tubo. (Posicionamento da sonda pode afetar se as espumas solução ou não durante a sonicação. Tipicamente, a formação de espuma indica que o DNA sonicado será mal cortado.) Sonicate suspensão 6 vezes durante 20 s. As amostras devem ser mantidos em um banho de água gelada durante a sonicação. Para diminuir a formação de espuma, inicialmente potência de saída a 0 e aumentar manualmente a potência final durante a primeira explosão. (Se não é significativa a formação de espuma, as bolhas podem ser removidas por centrifugação a 20.000 g seguido por ressuspensão suave de todo o material, sem deixar bolhas de espuma.) Giram a 20.000 g por 10 min a 4 ° C para pellet detritos e colheita do sobrenadante em um tubo de 1,5 ml. Economize 50 ul de lisado de células de cada amostra de DNA como entrada. Armazenar a -20 ° C. Pelo menos uma alíquota de DNA de entrada deve ser mantida por lote de lisado sonicate. Note-se que os efeitos dos efeitos da sonicação ea distribuição de tamanhos de fragmento resultante só pode ser verificada após crosslink reversão e purificação do DNA. Imunoprecipitação da cromatina Adicione a quantidade cromatina equivalente a 5 x 10 7 – 1 x 10 8 células de sonicação Cell, o passo 4 para os 50 mix de anticorpos / mL magnética talão de Preparação de esferas magnéticas, Passo 6, com um volume final de 1 ml (Pode ser possível ajustar com Tampão de Lise, se alguma vez). Incubar overnight em rotator a 4 ° C. Lavar Coletar contas usando Dynal MPC. Colocar os tubos no rack. Permitir que contas de recolher no lado do tubo. Isto deve ser levar cerca de 20 s. Inverter rack de duas vezes para ajudar a coletar todas as esferas. Remover o sobrenadante com pipeta, trocando as pontas entre as amostras. Adicionar 1 ml Tampão de Lise a cada tubo e contas delicadamente ressuspender. Isto pode ser feito através da remoção da banda magnética do rack e rack invertendo a, com tubos ainda em vigor – 20/10 vezes ou até as contas são uniformemente ressuspenso. Colete esferas. Retire o sobrenadante por pipetador. Repita este lavar 5 vezes mais, trocando as pontas entre lavagens. Lavar contas 6 vezes em 1 ml IP1 Buffer, conforme descrito na Etapa 2. Lavar contas 6 vezes em 1 ml de buffer IP2, conforme descrito na Etapa 2. Lavar contas 6 vezes em 1 ml TE 8,0 Buffer, conforme descrito na Etapa 2. Giram em 960 g por 3 min a 4 ° C e remover qualquer tampão TE residual. Eluição Adicionar 210 mL de tampão de eluição e material eluir de contas, incubando os tubos em banho-maria a 65 ° C por 15 min. Vortex brevemente cada 2 min. Esta incubação pode ser prorrogado, desde que 30 min, o que pode ajudar a melhorar a recuperação do eluato. Spin down contas a 16.000 g por 1 min em temperatura ambiente. Remover 200 mL do sobrenadante e transferir para novo tubo. Material pode ser congelado a -20 ° C e armazenados durante a noite. Reversão Crosslink Reversa crosslink o DNA imunoprecipitação da Etapa de eluição, 3, incubando a 65 ° C por um período mínimo de 6 horas e um máximo de 15 h (Tempos mais longos de reversão crosslink geralmente resultam em aumento de ruído na análise microarray). Esta incubação pode ser feito em um forno para que o tubo é aquecida uniformemente e há menos de condensação formado. Thaw 50 ul de DNA de entrada reservada após sonicação (Passo 13), adicionar 150 mL (3 volumes) de tampão de eluição e misturar. Reverter este crosslink DNA de entrada através da incubação a 65 ° C como em Crosslink reversão, a Etapa 1. A partir deste ponto, cada tubo de imunoprecipitação ou DNA de entrada é considerado como um tubo separado ou amostra para processamento posterior passos. DNA de purificação Adicionar 8 mL de 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg de concentração ml-1 final), misturar por vezes invertendo o tubo várias e incubar a 37 ° C por 2 h. Adicionar 4 mL de 20 mg ml-1 Proteinase K (0,2 mg ml-1 de concentração final) e misture, invertendo o tubo várias vezes e incubar a 55 ° C por 2 h. Adicionar 400 mL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (P: C: IA), vórtice e fases distintas com 2 ml tubo Phaselock Pesada (siga as instruções fornecidas pelo Eppendorf). Se o P: C: solução de IA é velho ou está em pH baixo, haverá degradation de DNA, causando ruído na análise microarray e perda de detecção de alvos válidos. Transferência de fase aquosa para novo tubo de centrífuga contendo 16 mL de NaCl 5M (200 mM) concentração final) e 1,5 mL de 20 μ mL-1 de glicogênio (30 no total mcg). Adicionar 800 mL EtOH. Incubar durante uma noite a -20 ° C ou 30 min a -80 ° C. Giram a 20.000 g por 10 min a 4 ° C para pellet de DNA. Lavar pellets, adicionando 500 mL de EtOH 80%, vortex para voltar a suspender pellet e girar novamente a 20.000 g por 5 min a 4 ° C. Remova qualquer EtOH 80% restantes. Girar os tubos rapidamente para recolher o líquido remanescente e remover o líquido com um pipetteman, evitando o sedimento. Deixar o ar seco até tubos de pellets são apenas seca: pelotas deve ainda manter uma aparência úmida. Ressuspender cada pellet em 70 mL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Overdrying dessas pelotas pode torná-los difíceis de ressuspender, ou sejam susceptíveis de flake e casca de longe do lado do tubo. Opcional: Economize 15 mL de amostra de imunoprecipitação para uso futuro. Este material pode ser usado para executar gene específico PCR confirmação dos resultados microarray. Quantificar a concentração por absorção UV (260 nm). NB: As seguintes etapas incluindo a preparação e ampliação da biblioteca um uso modificado GenomePLex WGA kit com Mix Amp 10X de Sigma sem dNTPs: Preparação biblioteca Disponível no kit WGA GenomePLex com Mix Amp 10X de Sigma Adicionar 2 l da 1X tampão Preparação Biblioteca para 10 ml de amostra de DNA a partir do DNA Purification, Etapa 11 em um tubo de PCR. Adicionar 1 ml de solução estabilizadora Biblioteca. Vortex completamente, consolidar por centrifugação, e coloque no termociclador a 95 ° C por 2 minutos. Esfriar a amostra em gelo, consolidar por centrifugação por centrifugação, e depois voltar para o gelo. Adicionar 1 ml de Biblioteca Enzyme Preparação, vortex completamente, e então centrifugar brevemente. Colocar a amostra em um termociclador e incubar da seguinte forma: 16 ° C por 20 minutos 24 ° C por 20 minutos 37 ° C por 20 minutos 75 ° C por 5 minutos 4 ° C segurar Remover amostras do termociclador e brevemente centrífuga. Amostras podem ser amplificados imediatamente ou armazenados a 20 ° C por três dias. Amplificação Disponível no kit WGA GenomePLex com Mix Amp 10X de Sigma A mistura principal é preparada adicionando os seguintes reagentes à reação 15 mL a partir da Etapa 3, abaixo: 7,5 mL da mistura de Amp 10X (sem dNTPs) 5,0 mL de DNA polimerase WGA 3,0 mL de uma 10 mM dNTP (cada) de estoque (concentração final 0,4 mM) Traga volume final de reação para 75 mL com água livre de nuclease Vortex completamente. Centrifugar brevemente, e começar a termociclagem. Desnaturação inicial 95 ° C por 3 minutos Realizar 14 ciclos da seguinte forma: Desnaturar 94 ° C por 15 segundos Recozer / Extend 65 ° C por 5 minutos Após o ciclismo é completo, manter as reações a 4 ° C ou armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para análise ou de purificação. Purificar o DNA com PCR Purification ® Kit de Quiagen de acordo com as instruções do fabricante e quantificar a concentração por absorção UV (260 nm). Realizar novamente um ciclo de amplificação de Preparação Biblioteca, a Etapa 1 até Amplificação, Etapa 2, com as seguintes adaptações. • Em relação à quantidade de DNA necessário partir do Passo 3, acima, para iniciar o processo de fragmentação: Se a concentração de DNA é de cerca de 200-300 mg / ml, use 2,5 mL de amostra e ajustar com água para um volume final de 10 ml. Se a concentração de DNA é de cerca de 50-60 mcg / ml, usar 5 mL de amostra e ajustar com água para um volume final de 10 ml. • Neste processo de amplificação segundo, com dNTPs dTTPs para a mistura principal é a troca de uma mistura incluindo 10 mM dATP, dGTP 10 mM, 10 mM dCTP e dTTP 8 mM e 2 mM dUTP na mesma concentração que a mistura anterior. DNA medida usando espectrofotômetro UV-Vis (260 nm). Normalmente, superior a 9 mg de DNA amplificado é obtido a partir de cada reação. NB: A rotulagem das metas de DNA é realizado com o GeneChip ® WT DNA de fita dupla Kit Rotulagem Terminal da Affymetrix acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito abaixo: Alvos fragmento amplificado Fragmento de amostras usando a tabela apropriada abaixo, dependendo do que tipo array a meta será híbridoized para. Tabela 1. Mix de fragmentação para arrays única Volume componente / Montante em um Rxn DNA de fita dupla 7,5 mg 10X cDNA Fragmentação 4,8 mL UDG, 10 U / mL 1,5 mL APE 1, 100 U / mL 2,25 mL Nuclease água livre de até 48 mL Disponível no ® WT GeneChip DNA de fita dupla Kit Rotulagem Terminal da Affymetrix Tabela 2. Mix fragmentação para multi-array sets Volume componente / Montante em um Rxn Double-stranded DNA 9 mg 10X cDNA Fragmentação 4,8 mL UDG, 10 U / mL 1,5 mL APE 1, 100 U / mL 2,25 mL Nuclease água livre de até 48 Disponível no ® WT GeneChip DNA de fita dupla Kit Rotulagem Terminal da Affymetrix Configurar mix fragmentação de acordo com uma tabelas acima. Flick mix-spin down e os tubos. Incubar as reações em: 37 ° C por 1 h. 93 ° C por 2 min. 4 ° C por pelo menos 2 minutos. Flick-mix, girar os tubos, e transferir 45 mL da amostra para um tubo novo. Retire 2 mL de cada amostra de gel shift-análise. Rótulo DNA double-stranded fragmentada Prepare o double-stranded Mix Rotulagem DNA, conforme descrito na tabela abaixo: Tabela 3. Composição do double-stranded DNA Mix Rotulagem Volume componente / Montante em um Rxn 5X tampão TdT 12 mL TdT 2 mL DNA Reagente Rotulagem, 5 mM 1 ml Volume total de 15 mL Disponível no ® WT GeneChip DNA de fita dupla Kit Rotulagem Terminal da Affymetrix Adicionar 15 mL da Mix Labeling double-stranded DNA de amostras de DNA, flick-mix, e spin-las. Incubar as reações em: 37 ° C por 60 min. 70 ° C por 10 min. 4 ° C por pelo menos 2 min. Retire 2 mL de cada amostra de gel shift-análise. Gel shift-análise Prepare a 4% gel agarose. Incubar amostras dos alvos fragmento amplificado, Step 5 e DNA double-stranded Etiqueta fragmentado, Passo 4 a 65 ° C por 2 min. Adicionar 10 ml de Estreptavidina (1 mg / ml), e amostras de incubar a temperatura ambiente por 5 min. Executar amostras a partir da Etapa 3 em um 4% agarose gel (Gel shift-análise, Etapa 1) para verificar a migração deslocamento dos produtos rotulagem. Hibridização array array de lavar Realizado pelo Centro de Genômica da Universidade da Califórnia Riverside. Análise da Matriz Realizada por análise computacional. COMPOSIÇÕES BUFFER: Bloco Solução: PBS + 0,5% albumina sérica bovina (BSA). Tampão de Lise: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,1% SDS 1mM PMSF PH final 7,5 IP1: Tampão de Lise + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 Dioxycholat de sódio 0,5% PH final 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA PH final 8,0 Eluição Buffer: TE Tampão + 1% SDS.