Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biyolistik Transfeksiyon İÇİN PROTOKOL Mermi yapma Bullets 6 aya kadar iyi, ama 2-3 ay sonra transfeksiyon verimliliği azalmaya başlayabilir. Bullets Dessicant pelet varlığında 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Flakon açılmadan önce oda sıcaklığına mermi depolandığı sintilasyon şişeleri, her zaman izin verin. Başlamadan önce hazır olması: Spermidin (0.05M) CaCl 2 (1M) EtOH (% 100 yüksek dereceli açılmamış şişe) Otoklavlı H 2 0 Transfekte olarak DNA Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml stok) 2 X 15 ml konik (2/bullet set) Boru (1 oyulmuş X ~ 30 inç / bullet seti) Sintilasyon şişeleri (1/bullet seti) Kuruma pelet 10 ml şırınga w / ucunda boru Tüp hazırlayın: Kuru ~ tüp istasyonu w / N 2 gaz (0.4 basıncı) en az 20 dakika bir tüp 30 inç (yaklaşık 2 inç sağ O-halka ötesine uzanan) . Altın boncuk DNA çökeltisi: Mikrosantrifüj tüp içinde 50 μmL toplam hacmi (maksimum 50 mg toplam DNA) transfekte DNA hazırlayın 6-8 mg altın tartmak ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer Altın 0.05M spermidin 100 mcL ekleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon Altın / spermidin DNA'nın 50 mcL ekleyin Vortex (yaklaşık 5 ayar) w / kapağı açık 1M CaCl 2 bilge 100 mcL bırakın . Sonikasyon kısa süreli (<5 sn) Oda sıcaklığında 10 dakika çökelti izin ver Kısaca sonikasyon Sonication sırasında PVP çözüm hazırlayın: (3,5 ml% 100 EtOH 7.5 20mg/ml PVP stokunun mcL ekleyin) mermi her set için 15 ml konik, 3.5mL seyreltik PVP PVP çözümü sulandırmak olun EtOH altın boncuk Durulama: Mikrosantrifüj 10 sn tam hızda altın boncuk Spin Süpernatant atın, ama altın boncuk üstüne küçük bir miktar sıvı tutmak Gerekirse 1ml EtOH 3X yıkayın, kısaca her zaman sonikasyon Süspanse edin PVP çözüm altın / DNA: 200 mcL 3,5 ml seyreltik PVP / EtOH çözüm altın pelletini tekrar Vortex tekrar süspansiyon için altın pelet (gerekirse kısaca sonikasyon) Yeni bir 15 ml konik, altın / PVP çözüm 200 mcL transfer Tüm altın, 15 ml konik devredilmiştir kadar bir defada 200 mcL PVP ekleyerek, bu şekilde devam edin ve son hacmi 3.2 mL Kaplama tüp: N 2 tüp istasyonu kapatın ve kuru tüp kaldırmak 10 ml şırınga kuru boru takın Gayretle 15 ml konik altın / PVP ile dolu sallamak Altın / PVP çözüm boru sonuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş olmak dikkatli emmek ~ 2 inç boru iki ucunda kuru bırakın Boru hala şırınga bağlı ve altın / PVP çözümü ile dolu, tüp geri istasyonu içine dikkatlice yerleştirin Mark çözüm oturur boru ucu Altın şırınga bağlı 5 dakika dinlendiriniz Yerleşik altın (arka yıkamak için değil emin olun) geride bırakmış, böylece şırınga çekerek çok yavaş çözüm Suck Şırınga çıkarın 90 ° Döndür ve 2 saniye bekletin 180 ° döndürün ve bir 2 saniye bekletin 5 saniye için tüp Döndür N 2 valf 0.4 arasında okur böylece açın – 0.5 ve 5 dakika boyunca kuruma ise altın kaplamalı boru spin. Tüp Kesme: Boru boru hazırlık istasyonu çıkarın ve işaretleri biter kesti. Etiketli bir sintilasyon flakon koyun kesme kartuşları yakalamak için boru kıyıcı altında Tüp kıyıcı boru ve tüp temiz ustura ile kesmek Sintilasyon flakon bir kuruma pelet yerleştirin. 4 Mağaza kartuşları ° C Atıcılık Doku Dilimleri Kültürlü dilim çekerken, kontaminasyonu önlemek için nispeten steril bir teknik istihdam için çok önemlidir. Mermi iki farklı yapıları çekim yaparken, her iki seti de aynı kartuş tutucu içine yüklenmiş olabilir, ancak namlu-liner ve ekran yapıları arasında değiştirilmesi gerektiğini unutmayın. Başlamadan önce hazır olması: DNA mermi (açmadan önce oda sıcaklığına kadar sintilasyon flakon sıcak izin) Doku dilimleri Gen Tabancası Helios Gen tabancası hortumu ile Helyum tankı bağlı </ P> Kartuş tutucu Yerinde plastik Namlu liner O-ring Difüzör (modifiye) Difüzör Ekran Forseps Hazırlayıcı gen tabancası: Kullanarak forseps kartuş tutucu içine altın kaplamalı plastik kartuşlarda yerleştirin. Kartuşu tutucu kilit ilk geri iterek, gen tabancasının içine yerleştirin Kilidi ile kartuş tutucu Güvenli O-ring ve güvenli bir yerde difüzör ekran ile bir varil liner edinin Gen tabancasının içine varil-liner Vida Gen tabancası ile kültür dilim Çekim: Kulak manşonlar koyun Hortum bağlı helyum gazı tankı içine gen tabancası Tak 180 PSI tankı üzerinde baskı Difüzör ekranı herhangi bir toz veya enkaz kaldırmak için havaya bir boş vur. Silahı ateşlemek için, ilk tetiği çekin, sonra silah sesi çıkarıncaya kadar güvenlik kilidi düğmesini bastırın. Boş Çekimden sonra, inkübatör dilim kaldırmak Avans tabancası ilk inşa etmek Yaklaşık 0.5 difüzör ekranı ile çekim dilim 1 inç Advance kartuş kuyuları arasında. Son iyi Çekimden sonra, kuvöz içine dilimlerini Helyum hortum tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın Sökün varil liner ve kartuşunu çıkarın ve kullanılan kabuklar Temizleme kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri: Yeri kartuşları, varil gömlekleri ve sabunlu su ile beher difüzör ekranları 20 dakika banyo sonikatör ve sonikasyon yerleştirin beher Tüm sabun artıkları kaldırılana kadar iyice su ile durulayın Bir saat için% 70 EtOH yıkayınız Kuruması için kuru kağıt havlu üzerine koyun bir gecede Temizlik kartuşları, varil gömlekleri, ve ekranlar sonra sonraki Biyolistik transfections yeniden Biyolistik Transfeksiyon Sorun giderme ipuçları Biyolistik transfeksiyon bazen suboptimal transfeksiyon koşulları neden olabilir. Bu çok az ya da çok fazla hücre transfekte çok yüksek veya çok düşük ekspresyon düzeyleri yol açabilir, ya da genel olarak sağlıksız hale doku dilim neden olabilir. Genellikle sağlıksız dilimleri sonucu basınç patlama. Optimal transfekte doku dilimler elde etmek için bazı ipuçları bulunmaktadır. : Dilim (ya da çok fazla hücre / dilim transfekte varsa) deneyin sağlıksız görünüyorsa artan çekim mesafesi azalan basınç gaz tankeri altın miktarını azaltarak Bio-Rad difüzör merkezi kesme ve difüzör ekranı ile merkezi yerine. Eğer çok az hücreler transfekte deneyin: çekim mesafesi azalan gaz tankeri giderek artan bir baskı altın miktarını artırarak / iyi doku dilim sayısını artırarak O-ring varil-liner sağlam olduğundan emin olun. Emin olun aynı çekim sırasında transfekte hem de çok sayıda ve çok az sayıda hücre ile dilimleri alırsanız: simetrik yukarıda silah tutan bu altın eşit boru iç kaplama. (Altın bir çizgi alıyorsanız, altın yerine bir kez daha hızlı bir oranda tüp süpernatantı çizmek ve azot açmadan önce altın uzun döndürmek Öte yandan, altın şeritli, Bu muhtemelen mermi yapımı sırasında çok fazla nem maruz kalma nedeniyle boru kaplama önce iyice kurulayın ve kapakları kapaklama) zamanında mermi hazırlanıyor, EtOH açılmamış bir şişe kullanarak emin olun. Transfeksiyon verimliliği en iyi görünüyorsa (# hücreleri / dilim transfekte), ancak ifade seviyesi çok yüksek veya çok düşük görünüyor: altın oran DNA ayarlayın. (Çok düşük ise, örneğin, altın miktarı korumak, ancak DNA miktarını artırmak.) çekim ve veri toplama arasındaki süreyi ayarlamak Yapıları çok az ifade alıyorsanız, çift transfeksiyon durumunda, emin olmak amacıyla, iki yapıları oranı uygun şekilde ayarlayın ve hem de yapıları aynı organizatörü altında olduğundan emin olun bir organizatörü dışı rekabet olmaz.