De voorbereiding van Gene Gun Bullets and biolistische Transfectie van Neuronen in Slice Cultuur

PROTOCOL VOOR biolistische Transfectie Het maken van kogels Kogels zijn goed voor maximaal 6 maanden, maar kan beginnen in de transfectie-efficiëntie afname na 2-3 maanden. Kogels moeten worden bewaard bij 4 ° C in de aanwezigheid van droogmiddel pellets. Altijd laten de scintillatieflesjes, waarin de kogels worden opgeslagen, opwarmen tot kamertemperatuur voor het openen van de flacon. Voordat u begint zijn klaar: Spermidine (0,05 M) CaCl 2 (1M) EtOH (100%-high grade-ongeopende fles) Geautoclaveerd H 2 0 DNA getransfecteerd worden Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml voorraad) 2 X 15 ml conische (2/bullet set) Buis (gesneden in een X ~ 30 inch / bullet set) Scintillatieflesjes (1/bullet set) Verdroging pellets 10 ml spuit w / buizen op het einde Bereid slangen: Droge ~ 30 inch van buis (ongeveer 2 cm verder reikt dan rechts O-ring) in de slang station w / N 2 gas (0,4 druk) gedurende een minimum van 20 minuten. Neerslaat DNA op goud kralen: Bereid je DNA te worden getransfecteerd in 50 μmL totale volume in microcentrifugebuis (maximaal 50 ug totaal DNA) Weeg 6-8 mg van goud en transfer naar een microcentrifugebuis Voeg 100 ul van 0,05 M spermidine aan goud en ultrasone trillingen gedurende 20 sec Voeg de 50 ul van DNA naar de goud / spermidine Vortex (ongeveer instelling 5) w / kap te openen Voeg druppelsgewijs 100 ul van 1 M CaCl 2 Ultrasone trillingen kort (<5 sec) Laat neerslag gedurende 10 min bij kamertemperatuur Ultrasone trillingen kort Bereid PVP-oplossing tijdens de ultrasoonapparaat: Maak verdunnen PVP-oplossing in 15 ml conische, 3.5ml verdund PVP voor elke set van kogels (voeg 7,5 pi van 20mg/ml PVP voorraad tot 3,5 ml 100% EtOH) Spoelen gouden kralen met EtOH: Spin down gouden kralen op volle snelheid voor 10 sec in microcentrifuge Gooi supernatant, maar houd een kleine hoeveelheid vloeistof op de top van gouden kralen Was 3X met 1 ml EtOH, kort met ultrasone trillingen elke keer, indien nodig, Resuspendeer goud / DNA in PVP-oplossing: Resuspendeer de gouden pellet in 200 pi van de 3,5 ml verdund PVP / EtOH-oplossing Vortex het goud pellet om opnieuw in suspensie (kort met ultrasone trillingen indien nodig) Breng de 200 pi van de goud / PVP-oplossing om een ​​nieuwe 15 ml conische Ga op deze manier, het toevoegen van 200 pi van PVP in een tijd totdat al het goud is overgedragen aan de 15 ml conisch, en het uiteindelijke volume is 3,2 ml Coating slangen: Schakel N 2 op de buis station en verwijder de gedroogde slangen Bevestig de gedroogde slang aan de 10 ml spuit Schud de 15 ml conische gevuld met goud / PVP Plaats het uiteinde van de slang in goud / PVP-oplossing en zuigen langzaam en voorzichtig om luchtbellen te vermijden Laat ~ 2 centimeter droog aan beide uiteinden van de buis Met de slang nog aan spuit en gevuld met de goud / PVP-oplossing, plaatst u voorzichtig de slang terug in het station Markeer de uiteinden van de buis waar de oplossing zit Laat het goud voor 5 min te regelen met de spuit bevestigd Suck-up de oplossing heel langzaam door te trekken de spuit, zodat de vaste goud blijft achter (zorg ervoor dat u back-wash) Koppel spuit Draai 90 ° en laat zitten twee seconden 180 ° draaien en laat zitten nog 2 seconden Draai buis voor 5 sec Zet de N 2, zodat de klep leest tussen de 0,4 tot 0,5 en spin de goud gecoate buizen tijdens het drogen gedurende 5 minuten. Snijden slangen: Verwijder de slang van de buis prep-station en snijd de uiteinden bij de merken. Zet een label scintillatieflesje onder de slang helikopter te snijden cartridges te vangen Plaats buizen in de slang chopper en snijd de slang met schoon scheermes Plaats een verdroging pellets in scintillatieflesje Bewaar cartridges bij 4 ° C Schieten Tissue Slices Bij het fotograferen gekweekte plakken, is het belangrijk om een ​​relatief steriele techniek gebruiken om besmetting te voorkomen. Vergeet niet dat bij het opnemen van twee verschillende constructen, beide reeksen kogels kunnen worden geladen in dezelfde cartridge houder, maar het vat-liner en het scherm moet worden veranderd tussen de constructen. Voordat u begint zijn klaar: DNA bullets (laten scintillatieflesje opwarmen tot kamertemperatuur voordat u deze opent) Weefsel plakken Helios Gene Gun Helium tank met gen pistool slang </ Li> Patroonhouder Vat liner met kunststof O-ring op zijn plaats Diffuser (gewijzigd) Diffuser Screen Pincet Prepping het gen gun: Met behulp van een tang plaats het goud gecoate plastic patronen in de patroonhouder. Plaats de cartridge houder in het gen pistool door eerst het terugdringen van sluis Bevestig de patroonhouder met slot Verkrijgen van een vat liner met een O-ring en de diffuser scherm stevig op zijn plaats Schroef de barrel-liner in het gen pistool Schieten gekweekt plakjes met het gen pistool: Zet oorkappen Steek het gen pistool in de slang aangesloten Helium gas tank Zet druk op de tank tot 180 PSI Schiet een leeg in de lucht om stof of vuil uit de diffusor scherm te verwijderen. Om het pistool schieten, eerst druk van de veiligheid vergrendeling knop ingedrukt totdat het pistool piept, trek vervolgens de trekker over. Na de opname van de lege, verwijder de plakjes uit de incubator Advance pistool om eerst te bouwen Schieten met de diffuser-scherm ongeveer 0,5 – 1 inch van de slice Vooraf de cartridge tussen de putten. Na de opname van de laatste goed, terug te plaatsen de plakjes in de incubator Schakel gas en laat de druk Voordat u het geweer van de Helium slang Schroef het vat liner, en verwijder de cartridge en de gebruikte schalen Reinigingscartridge houders en vat liners: Plaats cartridges, vat liners, en diffuser schermen in een bekerglas met water en zeep Plaats beker in bad ultrasoonapparaat en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten Grondig afspoelen met water tot alle zeepresten verwijderd zijn Soak in 70% EtOH voor een uur Plaats op droog papier handdoek 's nachts om te drogen Schoon cartridges, vat liners, en schermen kunnen worden hergebruikt in de daaropvolgende biolistische transfecties Trouble shooting tips voor biolistische Transfectie Biolistische transfectie kan soms resulteren in een suboptimale transfectie omstandigheden. Het kan leiden tot te weinig of te veel cellen getransfecteerd, te hoge of te lage expressie niveaus, of kan leiden tot weefsel plakjes te worden over het algemeen ongezond. Vaak ongezonde plakjes gevolg van de druk ontploffing. Hier zijn enkele tips om optimaal te getransfecteerde weefsel plakjes te verkrijgen. Als plakjes lijken te zijn ongezond (of als er te veel cellen worden getransfecteerd / slice), probeer dan: toenemende opnameafstand afnemende druk op de gas tank het verminderen van de hoeveelheid goud uitsnijden van het centrum van de Bio-Rad diffuser en het vervangen van het centrum met een diffuser scherm. Als er te weinig cellen worden getransfecteerd, probeer dan: afnemende opnameafstand toenemende druk op gas tank het verhogen van de hoeveelheid goud verhoging van het aantal van weefsel plakjes / goed Zorg ervoor dat de O-ring in het vat-liner intact is. Als u plakjes te krijgen met zowel te veel en te weinig cellen getransfecteerd in dezelfde schieten er zeker van: dat u houdt het pistool symmetrisch bovenstaande goed dat goud is gelijkmatig coaten van de binnenzijde van de slang. (Als u het krijgen van een lijn van goud, trekken uit het supernatans van de slang in een sneller tempo als het goud is geregeld en de gouden langer voordat het inschakelen van de stikstof te draaien. Als, aan de andere kant, je krijgt strepen van goud Dit is waarschijnlijk het gevolg van te veel vocht blootstelling tijdens bullet maken: zorg ervoor dat u een ongeopende fles EtOH gebruikt, dat de slang goed droog is voordat coating, en dat u aftopping deksels en het voorbereiden van kogels in een tijdig). Als transfectie-efficiëntie lijkt een optimale (# cellen getransfecteerd / slice), maar de uitdrukking niveau lijkt te hoog of te laag: aanpassen van de verhouding tussen DNA naar goud. (Bijv. als het te laag is behoud van de hoeveelheid goud, maar verhoging van het bedrag van het DNA.) aanpassen van de hoeveelheid tijd tussen opname en het verzamelen van gegevens In het geval van duale transfectie, als je krijgt te weinig uitdrukking van een van uw construeert, pas de verhouding van de twee constructies in de passende wijze en zorg ervoor dat beide constructen zijn onder dezelfde promotor, om zeker te maken dat een promotor zal niet uit-concurrentiebedingen de andere.