הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

פרוטוקול transfection BIOLISTIC הכנת כדורי כדורים טובים עד 6 חודשים, אך עלול להתחיל ירידה יעילות transfection לאחר 2-3 חודשים. תבליטים צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות כדורי dessicant. תמיד להניח צלוחיות הנצנץ, שבו הכדורים מאוחסנים, חם לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: Spermidine (0.05M) CaCl 2 (1M) EtOH (100% גבוהה כיתה בקבוק סגור) Autoclaved H 2 0 דנ"א להיות transfected Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 מ"ג / מ"ל ​​המלאי) 2 X 15 מ"ל חרוטי (2/bullet סט) Tubing (חתך לתוך 1 X ~ 30 אינץ' / להגדיר כדור) Scintillation בקבוקונים (סט 1/bullet) התייבשות כדורי 10 מ"ל מזרק w / צינורות בצד הכן צינורות: יבש ~ 30 אינץ' של צינורות (בערך 2 ס"מ מעבר הרחבת זכות O-Ring) בתחנת צינורות w / N 2 גז (0.4 הלחץ) למינימום של 20 דקות. מזרז DNA על חרוזי זהב: הכן את ה-DNA כדי להיות transfected בנפח 50 סך μmL בצינור microcentrifuge (50 מיקרוגרם לכל היותר DNA הכולל) לשקול את 6-8 מ"ג של זהב להעביר צינור microcentrifuge הוספת 100 μL של spermidine 0.05M אל זהב sonicate עבור 20 שניות מוסיפים את μL 50 של ה-DNA של זהב / spermidine וורטקס (סביב הגדרת 5) w / מכסה פתוח הוסף ירידה μL חכם של 100 1M CaCl 2 Sonicate בקצרה (<5 שניות) אפשר לזרז עבור 10 דקות ב temp חדר Sonicate בקצרה הכן פתרון PVP במהלך sonication: הפוך את לדלל פתרון PVP ב 15 מ"ל חרוטי, 3.5mL לדלל PVP עבור כל קבוצה של כדורים (להוסיף 7.5 μL של המניה PVP 20mg/ml ל -3.5 מ"ל EtOH 100%) שטיפה עם חרוזי זהב EtOH: ספין למטה חרוזי זהב במלוא המהירות על 10 שניות ב microcentrifuge בטל supernatant, אבל לשמור על כמות קטנה של נוזל על גבי חרוזי זהב לשטוף 3X עם 1ml EtOH, sonicate בקצרה בכל פעם, אם יהיה צורך Resuspend זהב / DNA בתמיסה PVP: Resuspend גלולה זהב μL 200 של פתרון 3.5 מ"ל PVP / EtOH לדלל מערבולת כדורית הזהב resuspend (בקצרה sonicate במידת הצורך) מעבירים את μL 200 זהב / פתרון ל PVP חדש 15 מ"ל חרוטי המשך בדרך זו, והוסיף 200 μL של PVP בכל פעם עד שכל הזהב הועבר 15 מ"ל חרוטי, ואת הנפח הסופי הוא 3.2 מ"ל ציפוי צינורות: בטל N 2 בתחנת צינורות ולהסיר צינורות יבשים צרף צינורות יבשים מזרק 10 מ"ל בתוקף לנער את 15 מ"ל חרוטי מלא זהב / PVP הנח את קצה הצינורית זהב / פתרון PVP ולמצוץ לאט להיות זהיר, כדי למנוע בועות השאר ~ 2 אינץ' יבש משני הקצוות של הצינור עם צינור המחובר עדיין מזרק מלא פתרון זהב / PVP, בזהירות המקום בחזרה צינורות לתוך התחנה סמן את קצות צינורות שבו פתרון יושב בואו הזהב להסתפק 5 דקות עם מזרק המצורף תמצצי-up הפתרון לאט מאוד על ידי משיכת את המזרק כך התיישבו זהב הוא נשאר מאחור (לוודא שלא לשטוף גב) נתק את המזרק סובב 90 ° ולתת לשבת 2 שניות סיבוב 180 מעלות ולתת לשבת עוד 2 שניות סיבוב הצינור למשך 5 שניות הפעל את N 2 שסתום כך נכתב בין 0.4-0.5 ו – ספין בצינור מצופה זהב תוך ייבוש דקות 5. חיתוך צינורות: הסר את צינורות מתחנת-הכנה בצינור וכיבה את ומסתיים הסימנים. שים בקבוקון scintillation מתויג תחת המסוק צינורות לתפוס מחסניות לחתוך המקום צינורות במסוק צינורות וחתך את צינורות עם סכין נקי מניחים כדורי התייבשות בבקבוקון scintillation אחסן מחסניות ב 4 ° C קליעה Slices רקמות בעת הירי פרוסות בתרבית, חשוב להעסיק טכניקה סטרילי יחסית, כדי למנוע זיהום. זכור, כי בעת הירי בשני דגמים שונים, שתי קבוצות של כדורים ניתן לטעון לתוך המחזק את המחסנית זהה, אך חבית אניה המסך צריך להיות שונה בין המבנים. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: ה-DNA כדורים (שלא בקבוקון scintillation חמים לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה) רקמות פרוסות הליוס Gene Gun מיכל הליום עם צינור אקדח גן מצורף </ Li> טונר בעל אניה חבית פלסטיק עם O-Ring במקום מפזר (שינה) מפזר מסך מצבטים Prepping את האקדח הגן: מלקחיים שימוש במקום מחסניות פלסטיק מצופה זהב לתוך המחזק את המחסנית. המקום בעל מחסנית לתוך אקדחו הגן על ידי הראשון להדוף לנעול Secure בעל מחסנית עם מנעול השג אניה חבית עם טבעת-O ואת המסך מפזר בבטחה במקום בורג חבית אניה לתוך האקדח גן קליעה פרוסות תרבותי עם אקדח הגן: לשים על אטמי אוזניים הכנס את האקדח לתוך הגן מחובר טנק צינור גז הליום הפעל את הלחץ על הטנק PSI 180 תירה ריק לאוויר על מנת להסיר כל אבק או פסולת מן המסך מפזר. כדי לירות באקדח, תחילה לדכא את לחצן בטיחות משתלבים עד צפצופים אקדח, ואז ללחוץ על ההדק. לאחר הירי ריק, להסיר את פרוסות מן החממה מראש אקדח תחילה לבנות תירה עם המסך מפזר על 0.5-1 ס"מ מן הפרוסה מראש את מחסנית בין בארות. לאחר הירי גם האחרון, במקום פרוסות בחזרה לתוך החממה כבה את לחץ הגז ולשחרר לפני ניתוק את האקדח מן הצינור הליום הברג החוצה את אניה לחבית, ולהסיר את מחסנית הפגזים בשימוש ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית: המקום מחסניות, ספינות לחבית, מסכי מפזר בכוס עם מים וסבון מניחים כוס ב sonicator אמבטיה sonicate עבור 20 דקות ביסודיות לשטוף עם מים עד שכל שאריות סבון יוסרו משרים EtOH 70% למשך שעה מניחים על מגבת נייר יבשה לילה יבש מחסניות נקי, ספינות לחבית, מסכי מכן ניתן לעשות שימוש חוזר transfections biolistic הבאים הירי צרות טיפים transfection Biolistic Transfection Biolistic יכולה לפעמים לגרום transfection תנאים טובים. זה יכול להוביל מעט מדי או יותר מדי תאים רבים transfected, גבוה מדי או נמוך מדי רמות הביטוי, או עלול לגרום פרוסות הרקמה להיות בריא בדרך כלל. לעיתים קרובות התוצאה פרוסות בריא מהפיצוץ את הלחץ. הנה כמה טיפים כדי לקבל פרוסות הרקמה transfected בצורה אופטימלית. אם פרוסות להיראות בריא (או אם תאים רבים מדי transfected / פרוסה), נסה: הירי הגדלת מרחק הפחתת הלחץ על מיכל הדלק הפחתת כמות זהב לחתוך החוצה את מרכז מפזר Bio-Rad והחלפת מרכז עם מסך מפזר. אם תאים מעטים מדי הם transfected, נסה: הקטנת מרחק הירי לחץ הולך וגובר על מיכל הדלק הגדלת כמות של זהב הגדלת מספר פרוסות הרקמה / טוב לוודא O-Ring ב-לחבית אניה לא נפגע. אם אתה לקבל פרוסות עם שני תאים רבים מדי, מעט מדי transfected במהלך הירי באותו לוודא: כי אתה מחזיק את האקדח באופן סימטרי מעל היטב זהב כי היא שווה הציפוי הפנימי של צינורות. (אם אתה מקבל שורה של זהב, למשוך את supernatant מן הצינור בקצב מהיר פעם זהב יש התיישבו וסובב את הזהב כבר לפני הפעלת חנקן. אם, מצד שני, אתה מקבל פסים של זהב , זה צפוי עקב חשיפה לחות רבה מדי במהלך ביצוע כדור: ודא שאתה משתמש בקבוק סגור של EtOH, כי צינורות הוא יבש לחלוטין לפני הציפוי, וכי אתה מכסת מכסים הכנת כדורי מבעוד מועד). אם יעילות transfection נראה אופטימלי (# תאים transfected / פרוסה), אך רמת הביטוי נראה גבוה מדי או נמוך מדי: להתאים את ה-DNA יחס זהב. (למשל, אם הוא נמוך מדי לשמור על כמות של זהב אלא להגדיל את כמות ה-DNA). להתאים את כמות הזמן בין ירי ואיסוף נתונים במקרה של transfection כפול, אם אתה מקבל ביטוי מעט מדי של אחד המבנים שלך, לשנות את היחס בין שני המבנים באופן המתאים וודא בונה הן תחת מקדם אותו, כדי לוודא שאף אחד היזם לא יהיה מחוץ להתחרות השני.