إعداد نقطي غون جين وترنسفكأيشن Biolistic من الخلايا العصبية في الثقافة شريحة
Summary
نحن تصف طريقة لإعداد الرصاص الحمض النووي الذهب المطلي وشرح استخدام هذه الرصاصات لtransfect biolistically الخلايا العصبية في قرن آمون شرائح المثقفين.
Abstract
ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية من transfecting خلايا الأنسجة بقذف مع جزيئات الحمض النووي عالية السرعة المغلفة. ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الحصين الفئران ، من الإعداد الأولي من الرصاص الحمض النووي المغلفة لاطلاق النار النهائي الثقافات شريحة عضوي النمط باستخدام مدفع الجينات. الجينات ترنسفكأيشن البندقية وسيلة فعالة وسهلة لtransfecting الخلايا العصبية ومفيد وخاصة بالنسبة للوضع العلامات fluorescently مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا في نسيج شريحة. في هذا الفيديو ، ونحن المخطط الأول الخطوات المطلوبة لجزيئات الذهب معطف مع الحمض النووي. كيف نظهر المقبل إلى خط داخل أنابيب بلاستيكية مع الرصاص الذهب / الحمض النووي ، وكيفية خفض هذه الأنابيب للحصول على خراطيش بلاستيكية للتحميل في البندقية الجينات. وأخيرا ، فإننا أداء ترنسفكأيشن biolistic الثقافات الفئران شريحة الحصين ، مما يدل على التعامل مع بيو راد هيليوس بندقية الجينات ، وتقديم المشورة اطلاق النار المتاعب للحصول على شرائح الأنسجة السليمة وtransfected على النحو الأمثل.
Protocol
Discussion
ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية transfecting من الخلايا عبر قصف الأنسجة الحية مع ارتفاع سرعة جزيئات الحمض النووي الذهب المطلي. في نقل الجينات بوساطة الجزيئات ، في الخلايا نتيجة transfected عامة عندما تأتي الرصاصة للراحة في النواة. في حين أن العديد من الأساليب المختلفة موجودة ترنسفكأيشن ، مثل microinjection lipofection ، فوسفات الكالسيوم electroporation ، وترنسفكأيشن ترنسفكأيشن الفيروسي ، ويمكن أن تقترح ترنسفكأيشن biolistic أقل من العمالة المكثفة ، وبديلة فعالة لtransfecting الخلايا التي لا transfected بسهولة باستخدام هذه الأساليب الأخرى. في الواقع ، وقد وضعت لأول مرة كوسيلة لنقل الجينات في النباتات منذ وجود جدار الخلية التي ترنسفكأيشن الصعبة باستخدام أساليب موجودة من قبل 1. وبالمثل ، فقد اكتسب شعبية biolistics في مجال علم الأعصاب منذ ما بعد الإنقسامية الخلايا العصبية والمعروف أن من الصعب transfect 2،3. على وجه الخصوص ، ومن المسلم به على نطاق واسع على أنها أسلوب المبدأ لاستخدامها في التجارب التي تهدف إلى تقييم التشكل غرامة قدرها واحد في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح سليمة. وصفت وسائل هنا تقديم شرح مفصل وشامل لكيفية تنفيذ ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الدماغ مثقف باستخدام الجينات باليد السلاح (البندقية الجينات هيليوس النظام ؛ بيو راد).
أصبح ترنسفكأيشن Biolistic الأسلوب المفضل لtransfecting الخلايا العصبية في ثقافة شريحة لأنه يسمح ترنسفكأيشن عدد متناثر من الخلايا في جميع أنحاء شريحة الدماغ. في هذه الطريقة ، يمكن فحص الخلايا العصبية الفردية في عزلة. لأن مناسبة بشكل خاص لهذه التقنية transfecting الخلايا العصبية في الدماغ شريحة ، وغالبا ما تستخدم في بالاشتراك مع 2 الفوتون المجهري ، لأن التصور 2 – الفوتون تمكن من استثارة الخلايا fluorescently المسمى عميقة داخل الأنسجة تشتت الضوء 4. بالفعل تم القبض على تكبير الصور عالية من الخلايا العصبية الهرمية قدم واحدة طوال هذا الفيديو باستخدام مجهر الليزر المخصصة بنيت 2 – الفوتون المسح. في الختام ترنسفكأيشن biolistic هو وسيلة فعالة لtransfecting الخلايا الفردية في سياق كثافة عالية من الخلايا المحيطة بها ، وعلى هذا النحو وقد ثبت مفيدة للغاية لوصفها fluorescently الخلايا العصبية الفردية في الثقافة شريحة العصبية.
Acknowledgements
نود أن نشكر كافة Lucanic وتشنغ Hwai جونغ للمساعدة في الحصول على الصور من شرائح منخفضة التكبير الحصين كامل المقدمة في هذا الفيديو. نود أيضا أن أشكر سارة باريش للمساعدة مع النص المرافق للفيديو.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
| 1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
| 100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
| Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
| Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
| Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
| Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
| Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
| Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
| Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
| O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
| Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
| PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
| Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
| Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
| Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
| Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |
References
- Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).
- Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
