Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

PROTOCOLO PARA TRANSFECÇÃO biobalística Fazer balas Balas são boas para até 6 meses, mas pode começar a diminuir em termos de eficiência de transfecção após 2-3 meses. Balas devem ser armazenados a 4 ° C na presença de pellets dessecante. Sempre deixe os frascos de cintilação, em que as balas são armazenados, à temperatura ambiente antes de abrir o frasco. Antes de começar tenho pronto: Espermidina (0,05 M) CaCl 2 (1M) EtOH (100% de alta qualidade-garrafa fechada) Autoclavado H 2 0 DNA a ser transfectadas Polivinilpirrolidona (PVP-20 ações mg / ml) 2 X 15 ml cônico (2/bullet set) Tubulação (cortado em 1 X ~ 30 polegadas conjunto bala /) Cintilação frascos (set 1/bullet) Pellets dessecação Seringa de 10 ml w / tubo na extremidade Prepare tubulação: Dry ~ 30 polegadas de tubo (cerca de 2 polegadas, ultrapassam direito O-ring), na estação tubo w / N 2 de gás (0,4 de pressão) para um mínimo de 20 min. Precipitar DNA em contas de ouro: Prepare DNA a ser transfectados em 50 volumes μmL total em tubo de microcentrífuga (DNA máximo de 50 mg no total) Pesar 6-8 mg de ouro e transferir para um tubo de microcentrífuga Adicionar 100 mL de 0,05 M espermidina ao ouro e à sonicate por 20 segundos Adicione o mL 50 de DNA ao ouro / espermidina Vortex (cerca de configuração 5) w / tampa aberta Add-drop 100 mL sábio de CaCl 2 1M Sonicate brevemente (<5 seg) Permitir a precipitar por 10 min em temperatura ambiente Sonicate brevemente Prepare a solução de PVP durante a sonicação: Faça solução diluída em 15 ml PVP cônica, 3,5 ml diluída PVP para cada conjunto de balas (adicionar 7,5 mL de 20mg/ml estoque PVP a 3,5 ml EtOH 100%) Lavagem contas de ouro com EtOH: Spin down contas de ouro a toda a velocidade por 10 segundos em microcentrífuga Elimine o sobrenadante, mas manter uma pequena quantidade de líquido em cima de contas de ouro Lavar 3X com 1ml EtOH, sonicate brevemente cada vez, se necessário Ressuspender ouro / DNA em solução PVP: Ressuspender o sedimento de ouro em 200 mL da solução diluída 3,5 ml PVP / EtOH Vortex da pelota de ouro para voltar a suspender (brevemente sonicate se necessário) Transferir os 200 mL de ouro / solução PVP para um novo 15 mL cônica Continue desta maneira, adicionando 200 mL de PVP em um tempo até todo o ouro foi transferido para a 15 mL cônica, eo volume final é de 3,2 mL Tubo de revestimento: Desligue N 2 na estação tubo e remover tubos secos Anexar tubos secos à seringa de 10 ml Agitar vigorosamente o 15 mL cônica cheia de ouro / PVP Coloque a extremidade do tubo em ouro / solução PVP e chupar lentamente tendo o cuidado de evitar bolhas Deixar ~ 2 polegadas seca de ambas as extremidades do tubo Com o tubo ainda ligado a seringa e preenchido com a solução de ouro / PVP, coloque cuidadosamente o tubo de volta na estação Mark as extremidades do tubo onde a solução fica Deixe o ouro se contentar com 5 min com a seringa conectada Sugar-up a solução muito lentamente puxando a seringa de modo que o ouro resolvido é deixado para trás (não se esqueça de fazer lavagem de volta) Separe a seringa Rodar 90 ° e deixe descansar 2 segundo Girar 180 ° e deixe descansar outro dois segundo Rode o tubo por 5 segundos Ligue o N 2, de modo que a válvula lê entre 0,4-0,5 e girar o tubo revestidas de ouro durante a secagem por 5 min. Corte de tubos: Remova a tubulação da estação prep-tubo e cortar as pontas na marca. Colocar um frasco de cintilação rotulado sob o helicóptero para pegar tubos de cartuchos de corte Tubulação lugar no helicóptero tubos e cortar o tubo com navalha limpa Coloque um pellets dessecação em frasco de cintilação Armazene os cartuchos a 4 ° C Tiroteio Slices Tissue Ao fotografar fatias cultivadas, é importante empregar uma técnica relativamente estéreis, a fim de evitar a contaminação. Lembre-se que ao fotografar duas construções diferentes, ambos os conjuntos de balas pode ser carregado no suporte do cartucho mesmo, mas o barril do forro e da tela deve ser alterado entre as construções. Antes de começar tenho pronto: Balas DNA (vamos frasco de cintilação à temperatura ambiente antes de abrir) Fatias de tecido Helios Gene Gun Hélio tanque com mangueira de arma gene ligado </ Li> Suporte do cartucho Forro de plástico barril com O-ring no lugar Difusor (modificado) Tela difusor Fórceps Preparar a arma gene: Forceps lugar usando o ouro cartuchos de plástico revestidas no suporte do cartucho. Coloque o suporte do cartucho na arma gene pela primeira empurrando bloqueio Segura o suporte do cartucho com bloqueio Obter um forro barril com um anel de vedação ea tela difusor firmemente no lugar Parafuso do cano-liner na arma gene Tiroteio fatias cultivadas com a arma gene: Coloque em aquecedores de orelha Ligue a arma gene em mangueira de gás hélio tanque conectado Aumente a pressão no tanque a 180 PSI Atire um espaço em branco no ar, a fim de remover qualquer poeira ou restos da tela difusor. Para disparar a arma, primeiro aperte o botão de bloqueio de segurança até que a arma emite um sinal sonoro, em seguida, puxe o gatilho. Depois de atirar no vazio, retire as fatias da incubadora Arma avançar para construir primeiro Atire com a tela difusor cerca de 0,5 – 1 polegada da fatia Antecedência o cartucho entre os poços. Depois de filmar o bem último, coloque as fatias de volta para a incubadora Desligue a pressão do gás e liberação antes de separar a arma da mangueira Hélio Desapertar forro do cano, e remova o cartucho e as conchas utilizadas Limpeza titulares cartucho e forros barril: Cartuchos lugar, forros barril, e telas de difusor em um copo com água e sabão Coloque um copo no sonicador banho e sonicate por 20 min Enxaguar com água até que todos os resíduos de sabão são removidos Mergulhe em EtOH 70% por uma hora Coloque sobre papel toalha para secar secar durante a noite Limpar cartuchos, forros barril, e as telas podem ser reutilizados em subseqüentes transfections biobalística Problemas dicas de fotografia para Transfection biobalística Transfecção biobalística às vezes pode resultar em condições de transfecção de qualidade inferior. Ela pode levar a muito poucos ou muito muitas células transfectadas, muito alta ou níveis de expressão muito baixa, ou pode causar fatias de tecido para tornar-se geralmente pouco saudável. Muitas vezes resultam fatias insalubres da explosão de pressão. Aqui estão algumas dicas para obter fatias de tecido ideal transfectadas. Se fatias parecem ser pouco saudável (ou se as células demais estão transfectadas / fatia), tente: distância de disparo aumentar diminuição da pressão sobre tanque de gás diminuindo a quantidade de ouro cortando o centro do difusor Bio-Rad e substituindo o centro com uma tela difusor. Se as células transfectadas são muito poucos, tente: diminuindo distância de disparo pressão crescente sobre tanque de gás aumentar a quantidade de ouro aumentar o número de fatias de tecido / poço certifique-se o O-ring no barril-liner está intacta. Se você obter fatias com ambas as células demais e demasiado poucos transfectadas durante as filmagens mesmo certifique-se: que você está segurando a arma simetricamente acima bem que o ouro é uniformemente revestimento interior da tubulação. (Se você está recebendo uma linha de ouro, extrair o sobrenadante do tubo a uma taxa mais rápida uma vez que o ouro tem estabelecido e girar o ouro mais antes de ligar o nitrogênio. Se, por outro lado, você está recebendo listras de ouro , este é provavelmente devido à exposição demasiada umidade durante a tomada de bala: certifique-se que você está usando uma garrafa fechada de EtOH, que a tubulação está completamente seco antes do revestimento, e que você nivelamento das tampas e preparar balas em tempo hábil). Se a eficiência de transfecção parece ótimo (# células transfectadas / fatia), mas o nível de expressão parece muito alta ou muito baixa: ajustar o DNA relação ao ouro. (Por exemplo, se for demasiado baixa manter a quantidade de ouro, mas aumentar a quantidade de DNA.) ajustar a quantidade de tempo entre fotografia e coleta de dados No caso de transfecção dual, se você está recebendo muito pouca expressão de um de seus construtos, ajustar a relação dos dois construtos de maneira apropriada e certifique-se que ambas as construções estão sob o mesmo promotor, para se certificar de que um promotor não vai competir fora do outro.