Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice

PROTOCOLLO per la trasfezione BIOLISTIC Nella produzione di proiettili Proiettili sono buoni per un massimo di 6 mesi, ma potrebbe cominciare a diminuire in termini di efficienza di trasfezione dopo 2-3 mesi. Proiettili deve essere conservato a 4 ° C in presenza di pellet essiccante. Sempre lasciato le fiale di scintillazione, in cui sono memorizzati proiettili, a temperatura ambiente prima di aprire il flacone. Prima di iniziare sono pronti: Spermidina (0,05 m) CaCl 2 (1M) EtOH (100% di alta qualità, non aperto bottiglia) Autoclavato H 2 0 Di DNA da transfettate Polivinilpirrolidone (PVP-20 mg / ml di brodo) 2 x 15 ml coniche (2/bullet set) Tubi (tagliato in 1 X ~ 30 pollici / set proiettile) Fiale di scintillazione (set 1/bullet) Essiccazione pellet Siringa da 10 ml w / tubazioni alla fine Preparare tubi: Secco ~ 30 pollici di tubo (circa 2 pollici si estende oltre a destra O-ring) nella stazione di tubo w / N 2 gas (0,4 pressione) per un minimo di 20 min. Precipitare il DNA perline d'oro: Preparare DNA da transfettate in 50 volumi μmL totale in provetta (massimo DNA 50 mg in totale) Pesare 6-8 mg di oro e di trasferimento in un tubo da microcentrifuga Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m a oro e ultrasuoni per 20 secondi Aggiungere i 50 ml di DNA per l'oro / spermidine Vortex (circa impostazione 5) w / cappello aperto Aggiungere goccia a goccia 100 l di CaCl 2 1M Sonicare brevemente (<5 sec) Lasciar decantare per 10 minuti a temperatura ambiente Sonicare brevemente Preparare la soluzione PVP durante la sonicazione: Fai la soluzione diluita di PVP in 15 ml, 3,5 ml diluire PVP per ogni set di proiettili (aggiungere 7,5 l di magazzino 20mg/ml PVP al 3,5 ml di EtOH 100%) Risciacquo perline oro con EtOH: Spin down perle d'oro alla massima velocità per 10 secondi in microcentrifuga Gettare il surnatante, ma tenere una piccola quantità di liquido sulla parte superiore di perline oro Lavare 3 volte con 1 ml di EtOH, ultrasuoni per un breve istante, se necessario Risospendere oro / DNA in soluzione PVP: Risospendere il pellet oro in 200 ml di ml 3,5 diluire PVP / EtOH soluzione Vortex il pellet oro per sospendere di nuovo (brevemente sonicare se necessario) Trasferire i 200 ml di oro / PVP soluzione ad un nuovo 15 ml conica Continuare in questo modo, aggiungendo 200 ml di PVP alla volta fino a tutto l'oro è stato trasferito il 15 ml conica, e il volume finale è di 3,2 ml Rivestimento tubi: Spegnere N 2 alla stazione di tubi e rimuovere tubi secca Collegare il tubo secca alla siringa da 10 ml Agitare vigorosamente i 15 ml conica riempita d'oro / PVP Posizionare l'estremità del tubo in oro / soluzione di PVP e succhiare lentamente, facendo attenzione ad evitare le bolle Lascia ~ 2 pollici a secco da entrambe le estremità del tubo Con il tubo ancora attaccato alla siringa e riempite con la soluzione d'oro / PVP, posizionare con attenzione il retro tubo nella stazione Segnare le estremità del tubo in cui la soluzione si trova Lasciate che l'oro accontentarsi di 5 minuti con la siringa collegata Succhiare-la soluzione molto lentamente tirando la siringa in modo che l'oro si stabilirono è lasciato alle spalle (non sono sicuro di fare back-wash) Staccare la siringa Ruota di 90 ° e lasciate riposare 2 secondi Ruotare di 180 ° e lasciate riposare altri 2 secondi Ruotare la provetta per 5 sec Accendere la N 2 in modo che la valvola si legge tra 0,4 – 0,5 e girare l'oro rivestite tubi durante l'asciugatura per 5 min. Taglio tubi: Rimuovere il tubo dal tubo preparazione-stazione e tagliare le estremità a marchi. Metti una fiala di scintillazione etichettati con l'elicottero tubi per prendere le cartucce taglio Tubo posto nel tubo di chopper e tagliare il tubo con il rasoio pulito Posizionare un pellet essiccazione in flaconcino scintillazione Conservare le cartucce a 4 ° C Shooting fette di tessuto Quando si riprende fette colto, è importante utilizzare una tecnica relativamente sterile per evitare contaminazioni. Ricordate che quando si scatta due costrutti differenti, entrambe le serie di proiettili che possono essere caricati nel supporto della cartuccia stessa, ma la canna-liner e lo schermo dovrebbe essere cambiato tra i costrutti. Prima di iniziare sono pronti: Proiettili del DNA (per non fiala di scintillazione a temperatura ambiente prima di aprire) Fette di tessuto Helios Gun Gene Serbatoio di elio con tubo gene pistola allegato </ Li> Cartuccia titolare Botte con fodera in plastica O-ring in posizione Diffusore (modificato) Diffusore schermo Forcipe Preparando la pistola gene: Forcipe utilizzando posto delle cartucce di plastica rivestiti in oro il supporto della cartuccia. Posizionare il supporto della cartuccia nella pistola gene dapprima spingendo indietro blocco Fissare il supporto della cartuccia con serratura Ottenere un rivestimento a botte con un O-ring e lo schermo diffusore saldamente in posizione Avvitare la canna-liner nella pistola gene Shooting fette di coltura con la pistola del gene: Indossare cuffie Collegare la pistola gene in tubo collegato serbatoio del gas elio Alzare la pressione sul serbatoio a 180 PSI Spara un vuoto in aria al fine di rimuovere ogni traccia di polvere o detriti dallo schermo diffusore. Per sparare la pistola, prima premere il pulsante di blocco di sicurezza fino a quando il bip pistola, poi premere il grilletto. Dopo lo scatto in bianco, togliere le fette dalla incubatore Anticipo pistola a costruire prima Spara con lo schermo diffusore di circa 0,5 – 1 pollice dalla fetta Anticipo la cartuccia tra i pozzi. Dopo aver sparato il bene ultimo, disporre le fette di nuovo nel incubatore Spegnere la pressione del gas e rilasciare prima di staccare la pistola dal tubo di elio Svitare il rivestimento barile, e rimuovere la cartuccia e le conchiglie utilizzate Pulizia titolari cartuccia e rivestimenti barile: Cartucce luogo, rivestimenti barile, e gli schermi diffusore in un bicchiere con acqua e sapone Bicchiere posto in bagno sonicatore e ultrasuoni per 20 minuti Sciacquare con acqua fino a quando tutti i residui di sapone vengono rimossi Mettere a bagno in 70% EtOH per un'ora Mettere su carta assorbente per asciugare asciugare durante la notte Pulire le cartucce, rivestimenti barile, e gli schermi possono essere riutilizzati nei successivi trasfezioni biolistic Riprese suggerimenti guai per Transfection Biolistic Trasfezione Biolistic a volte può risultare in condizioni non ottimali di trasfezione. Può portare a troppo pochi o troppo molte cellule transfettate, troppo alti o troppo bassi livelli di espressione, o può causare fette di tessuto a diventare generalmente malsano. Spesso il risultato malsano fette dall'esplosione di pressione. Ecco alcuni consigli per ottenere fette di tessuto in modo ottimale transfettate. Se le fette sembrano essere malsana (o se troppe cellule sono transfettate / fetta), prova: all'aumentare della distanza di tiro diminuzione di pressione sul serbatoio del gas diminuendo la quantità di oro tagliare fuori il centro della Bio-Rad diffusore e sostituire il centro con uno schermo diffusore. Se le cellule sono troppo pochi transfettate, prova: diminuzione distanza di ripresa crescente pressione sul serbatoio del gas aumentare la quantità di oro aumentando il numero di fette di tessuto / e assicurarsi che l'O-ring nella canna-liner è intatto. Se si ottengono fette con entrambe le celle troppi e troppo pochi transfettate durante le riprese stesse accertarsi che: che si sta tenendo la pistola simmetricamente sopra e che l'oro è uniforme rivestimento all'interno del tubo. (Se hai trovato una linea d'oro, tirare fuori il surnatante dal tubo ad una velocità maggiore una volta che l'oro si è stabilito e ruotare l'oro più a lungo prima di accendere l'azoto. Se, invece, hai trovato striature d'oro , questo è probabilmente dovuto all'esposizione troppa umidità durante rendendo proiettile: assicurarsi che si sta utilizzando una bottiglia chiusa di EtOH, che il tubo sia completamente asciutto prima di rivestimento, e che si tappatura coperchi e la preparazione di proiettili in un modo attuale). Se l'efficienza di trasfezione sembra ottimale (# cellule transfettate / fetta), ma il livello di espressione sembra troppo alta o troppo bassa: regolare il rapporto di DNA in oro. (Ad esempio, se è troppo basso mantenere la quantità di oro, ma aumentare la quantità di DNA.) regolare la quantità di tempo tra le riprese e la raccolta dati Nel caso di transfezione doppio, se hai trovato espressione troppo poco di uno dei tuoi costrutti, regolare il rapporto tra i due costrutti in modo appropriato e fare in modo che entrambi i costrutti sono sotto il promotore stesso, in modo da assicurarsi che uno promotore non entrare in competizione l'altro.