Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Gran parte del proteoma humano sigue estando mal caracterizado. El “efecto farola” descrito por Dunham y Kustatscher et al. se refiere al fenómeno en el que las proteínas ampliamente investigadas reciben más atención, dejando de lado las proteínas poco estudiadas ^1,2. Los factores que contribuyen a este efecto incluyen la importancia biológica y la relevancia de la enfermedad de ciertas proteínas. Además, las investigaciones previas que ofrecen conocimientos fundamentales, así como la disponibilidad de herramientas para el análisis funcional, estimulan aún más la investigación sobre proteínas altamente estudiadas ^1,2. Proyectos como la Iniciativa de Proteínas Poco Estudiadas, el Consorcio de Genómica Estructural y la Iniciativa de Función Enzimática tienen como objetivo caracterizar proteínas poco estudiadas utilizando proteómica estructural y funcional ^2,3,4. Un enfoque complementario para identificar las funciones moleculares de las proteínas poco estudiadas es examinar las interacciones de estas proteínas con moléculas pequeñas para obtener información valiosa sobre la regulación y la especificidad del sustrato.

La unión de moléculas pequeñas puede aumentar la estabilidad térmica de una proteína⁵. Este fenómeno, conocido como estabilización de la conformación inducida por el ligando, a menudo resulta en un aumento en la temperatura de fusión de una proteína, proporcionando una indicación medible de la unión del ligando⁶. La estabilidad térmica de una proteína se puede medir utilizando fluorimetría diferencial de barrido (DSF), también conocida como termofluor, o ensayo de desplazamiento térmico (TSA)7,8,9,10. En la TSA, una muestra de proteína se somete a temperaturas crecientes en presencia de un colorante sensible al medio ambiente⁶. A medida que la proteína se despliega y se desnaturaliza, el colorante se une a las regiones hidrofóbicas expuestas de la proteína y emite fluorescencia. Los colorantes fluorescentes extrínsecos, o tintes sensibles al medio ambiente, carecen de fluorescencia intrínseca y, en cambio, emiten fluorescencia al interactuar con su molécula objetivo ^9,11,12. El colorante más utilizado, SYPRO Orange, ofrece varias ventajas, como una mayor estabilidad y una fluorescencia de fondo mínima ^8,9,12. En particular, SYPRO Orange es compatible con los sistemas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) debido a sus longitudes de onda de excitación y emisión de alrededor de 470 nm y 570 nm, respectivamente. Esta característica única permite mediciones de alto rendimiento, precisas y sensibles que son compatibles con los sistemas de detección de fluorescencia comúnmente utilizados en los sistemas RT-PCR⁸.

La TSA es una herramienta versátil para investigar las interacciones de las proteínas con posibles cofactores o fármacos y para identificar las condiciones estabilizadoras de la cristalografía. Algunas de sus ventajas sobre otros métodos de cribado son su relativa simplicidad de configuración y alto rendimiento con placas de 96 o 384 pocillos 13,14,15. El desarrollo de esta técnica ha sido transformador para los estudios de descubrimiento de fármacos, ya que ofrece comodidad y permite el estudio de diversos aditivos como iones, ligandos y fármacos ^6,16. Además, la adaptabilidad de la TSA ha animado a los científicos a ampliar su utilidad, facilitando la medición de las afinidades de unión junto con los ensayos de cribado^17,18. La TSA es una herramienta eficaz en los estudios de biología estructural para identificar las condiciones que promueven la estabilización de la proteína de interés para la cristalización¹⁹. Por lo tanto, su flexibilidad y relativa facilidad han posicionado a la TSA como una técnica fundamental en la caracterización de proteínas. Aquí, usaremos TSA para analizar la unión de metales y nucleótidos a la pseudoquinasa poco estudiada, la selenoproteína O (SelO), como ejemplo.

Las quinasas son una de las familias de proteínas más atacadas en el descubrimiento de^{fármacos 20}. Se predice que aproximadamente el 10% de las quinasas humanas son inactivas y se denominan pseudoquinasas porque carecen de los residuos catalíticos clave necesarios para la catálisis^21,22. La selenoproteína O (SelO) es una pseudoquinasa conservada evolutivamente que carece del aspartato conservado en el motivo catalítico HRD²³. En los eucariotas, SelO se localiza en las mitocondrias y protege a las células del estrés oxidativo^24,25. Los análisis estructurales y bioquímicos muestran que SelO transfiere monofosfato de adenosina (AMP) del ATP a sustratos proteicos en una modificación postraduccional conocida como AMPilation²⁵. Estudios recientes indican que las enzimas que catalizan la AMPilación pueden unirse a nucleótidos alternativos como UTP in vitro^26,27. En particular, los estudios han demostrado que el homólogo SelO de Salmonella typhimurium cataliza la proteína UMPilación, o la transferencia de UMP, de una manera dependiente del manganeso²⁸. Teniendo en cuenta estas intrigantes observaciones, probamos la unión de SelO a ATP y UTP en presencia de magnesio y manganeso, sirviendo como un ejemplo representativo de las aplicaciones de TSA. El siguiente protocolo se puede adaptar fácilmente para optimizar y examinar las interacciones de otras proteínas y aditivos de interés.