שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O
Summary
כאן, אנו מציגים את מבחן השינוי התרמי, טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המשמשת לחקר הקישור של מולקולות קטנות לחלבונים בעלי עניין.
Abstract
הגדרת חשיבותם הביולוגית של חלבונים בעלי תפקידים לא ידועים מציבה מכשול משמעותי בהבנת תהליכים תאיים. אף על פי שתחזיות ביואינפורמטיות ומבניות תרמו לחקר חלבונים לא ידועים, אימותים ניסיוניים במבחנה נפגעים לעתים קרובות על ידי התנאים האופטימליים וקו-פקטורים הדרושים לפעילות ביוכימית. קשירת קו-פקטור חיונית לא רק לפעילות של אנזימים מסוימים, אלא גם עשויה לשפר את היציבות התרמית של החלבון. אחד היישומים המעשיים של תופעה זו טמון בניצול השינוי ביציבות התרמית, כפי שנמדד על ידי שינויים בטמפרטורת ההתכה של החלבון, כדי לבחון את קשירת הליגנד.
בדיקת שינוי תרמי (TSA) יכולה לשמש לניתוח הקישור של ליגנדות שונות לחלבון המעניין או למצוא מצב מייצב לביצוע ניסויים כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. כאן נתאר פרוטוקול עבור TSA המשתמש בפסאודוקינאז, Selenoprotein O (SelO), לשיטה פשוטה ובעלת תפוקה גבוהה לבדיקת קשירת מתכת ונוקלאוטידים. בניגוד לקינאזות קנוניות, SelO קושר ATP בכיוון הפוך כדי לזרז את העברת AMP לשרשראות הצד ההידרוקסיל של חלבונים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation חלבון. על ידי מינוף השינוי בטמפרטורות ההתכה, אנו מספקים תובנות חיוניות לגבי האינטראקציות המולקולריות העומדות בבסיס פונקציית SelO.
Introduction
חלק גדול מהפרוטאום האנושי נותר מאופיין בצורה גרועה. “אפקט תאורת הרחוב” המתואר על ידי דנהם וקוסטצ’ר ואחרים מתייחס לתופעה שבה חלבונים שנחקרו בהרחבה מקבלים תשומת לב רבה יותר, ומשאירים חלבונים שלא נחקרו מספיק מתעלמיםמ-1,2. גורמים התורמים להשפעה זו כוללים את החשיבות הביולוגית ואת הרלוונטיות של מחלות של חלבונים מסוימים. יתר על כן, מחקר קודם המציע ידע בסיסי, כמו גם את הזמינות של כלים לניתוח פונקציונלי, עוד יותר מגרה מחקר על חלבונים נחקרים מאוד 1,2. פרויקטים כגון Understudied Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium ו-Enzyme Function Initiative שואפים לאפיין חלבונים שלא נחקרו מספיק באמצעות פרוטאומיקה מבנית ותפקודית 2,3,4. גישה משלימה לזיהוי הפונקציות המולקולריות של חלבונים שלא נחקרו מספיק היא לבחון את האינטראקציות של חלבונים אלה עם מולקולות קטנות כדי לקבל תובנות חשובות לגבי הוויסות וספציפיות המצע.
קשירה של מולקולות קטנות יכולה להגביר את היציבות התרמית של חלבון5. תופעה זו, הידועה בשם ייצוב קונפורמציה המושרה על ידי ליגנד, גורמת לעיתים קרובות לעלייה בטמפרטורת ההתכה של חלבון, ומספקת אינדיקציה מדידה לקשירת ליגנד6. ניתן למדוד את היציבות התרמית של חלבון באמצעות פלואורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSF), הידועה גם בשם Thermofluor, או Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. ב- TSA, דגימת חלבון נתונה לטמפרטורות עולות בנוכחות צבע רגיש לסביבה6. כאשר החלבון מתפתח ומתפרק, הצבע נקשר לאזורים ההידרופוביים החשופים של החלבון ופולט פלואורסצנטיות. צבעים פלואורסצנטיים חיצוניים, או צבעים רגישים לסביבה, חסרים פלואורסצנטיות פנימית ובמקום זאת פלואורסצנטיים באינטראקציה עם מולקולת המטרה שלהם 9,11,12. הצבע הנפוץ ביותר, SYPRO Orange, מציע מספר יתרונות כגון יציבות משופרת ופלואורסצנטיות רקע מינימלית 8,9,12. יש לציין כי SYPRO Orange תואם למערכות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) בהתחשב באורכי גל העירור והפליטה שלו סביב 470 ננומטר ו-570 ננומטר, בהתאמה. תכונה ייחודית זו מאפשרת מדידות בעלות תפוקה גבוהה, מדויקות ורגישות התואמות למערכות גילוי פלואורסצנטיות הנפוצות במערכות RT-PCR8.
TSA הוא כלי רב-תכליתי לחקר אינטראקציות חלבונים עם גורמים משלימים או תרופות פוטנציאליים ולזיהוי תנאים מייצבים לקריסטלוגרפיה. חלק מיתרונותיו על פני שיטות סינון אחרות הם פשטות ההתקנה היחסית שלו והתפוקה הגבוהה שלו עם לוחות 96 או 384 בארות 13,14,15. הפיתוח של טכניקה זו היה טרנספורמטיבי עבור מחקרים גילוי תרופות, מציע נוחות ומאפשר מחקר של תוספים מגוונים כגון יונים, ליגנדות, ותרופות 6,16. יתר על כן, יכולת ההסתגלות של TSA עודדה מדענים להרחיב את התועלת שלה, מה שמקל על מדידת זיקות מחייבות לצד מבחני הסינון 17,18. TSA הוא כלי יעיל במחקרי ביולוגיה מבנית לזיהוי תנאים המקדמים את ייצוב החלבון המעניין להתגבשות19. לפיכך, גמישותו וקלילותו היחסית מיצבו את TSA כטכניקת אבן פינה באפיון חלבונים. כאן, נשתמש ב- TSA כדי לנתח את הקישור של מתכות ונוקלאוטיד לפסאודוקינאז שלא נחקר, Selenoprotein O (SelO), כדוגמה.
קינאזות הן אחת ממשפחות החלבונים הממוקדות ביותר בגילוי תרופות20. כ -10% מהקינאזות האנושיות צפויות להיות לא פעילות ונקראות פסאודוקינזות מכיוון שהן חסרות שאריות קטליטיות, הדרושות לקטליזה 21,22. Selenoprotein O (SelO) הוא פסאודוקינאז משומר אבולוציונית שחסר את האספרטט השמור במוטיב HRD הקטליטי23. באיקריוטים, SelO מתמקם במיטוכונדריה ומגן על התאים מפני עקה חמצונית 24,25. ניתוחים מבניים וביוכימיים מראים כי SelO מעביר אדנוזין מונופוספט (AMP) מ-ATP למצעים חלבוניים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation25. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאנזימים המזרזים AMPylation עשויים לקשור נוקלאוטידים חלופיים כגון UTP in vitro 26,27. יש לציין כי מחקרים הוכיחו כי הומולוג SelO מסלמונלה טיפימוריום מזרז את החלבון UMPylation, או העברת UMP, באופן תלוי מנגן28. לאור התצפיות המסקרנות הללו, אנו בודקים את הקישור של SelO ל-ATP ול-UTP בנוכחות מגנזיום ומנגן, ומשמשים דוגמה מייצגת ליישומים של TSA. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא כדי לייעל ולבחון את האינטראקציות של חלבונים ותוספים אחרים בעלי עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת השינוי התרמי (TSA) משמשת כשיטה יעילה לסינון אינטראקציות חלבון-ליגנד, כולל אלה עם גורמים משלימים ומעכבים. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TSA כדי למדוד את הקישור של הפסאודוקינאז SelO לנוקלאוטידים ולקטיונים דו-ערכיים. הממצאים שלנו מראים כי SelO מציג יציבות תרמית מוגברת בנוכחות ATP ו-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. הוא W.W. Caruth, Jr. Scholar במחקר ביו-רפואי, מניעת סרטן ומכון המחקר של טקסס (CPRIT) מלגאי, ומרכז צ’ארלס וג’יין פאק למטבוליזם מינרלי ומחקר קליני מלגאי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) ו-Welch (I-2046-20230405).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383-10G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Avanti J-15R with microplate carrier assembly | Beckman Coulter | C19416 | |
| CFX Opus 384 Real-time PCR system | Bio-Rad | 12011452 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3805 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | M3634-500G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| SYPRO Orange Protein Gel stain | Sigma Aldrich | S5692-500UL | |
| Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma Aldrich | U6625-100MG | used for representative results but not required to perfom TSA |
References
- Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
- Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
- Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19 (2014).
- Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018 (2023).
- Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
- Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-29 (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
- Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , (2023).
- Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688 (2023).
- Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
- Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
- Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
- Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
- Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650 (2019).
- Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), 51809 (2014).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
- Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894 (2024).
- Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
- Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
- Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138 (2012).
- Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518 (2014).
- Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821.e19 (2018).
- Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279 (2023).
- Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
- Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161 (2020).
- Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
- Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024 (2017).
- Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
- Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022 (2024).
- Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 2), 209-214 (2013).
- Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
- Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
- Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
- Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).
