Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Grande parte do proteoma humano permanece mal caracterizado. O “efeito de iluminação pública” descrito por Dunham e Kustatscher et al. refere-se ao fenômeno em que proteínas extensivamente pesquisadas recebem mais atenção, deixando as proteínas pouco estudadas negligenciadas ^1,2. Os fatores que contribuem para esse efeito incluem a importância biológica e a relevância da doença de certas proteínas. Além disso, pesquisas prévias que oferecem conhecimento fundamental, bem como a disponibilidade de ferramentas para análise funcional, estimulam ainda mais a pesquisa sobre proteínas altamente estudadas ^1,2. Projetos como a Iniciativa de Proteínas Pouco Estudadas, o Consórcio de Genômica Estrutural e a Iniciativa de Função Enzimática visam caracterizar proteínas pouco estudadas usando proteômica estrutural e funcional ^2,3,4. Uma abordagem complementar para identificar as funções moleculares de proteínas pouco estudadas é examinar as interações dessas proteínas com pequenas moléculas para obter informações valiosas sobre a regulação e a especificidade do substrato.

A ligação de pequenas moléculas pode aumentar a estabilidade térmica de uma proteína⁵. Esse fenômeno, conhecido como estabilização de conformação induzida por ligante, geralmente resulta em um aumento na temperatura de fusão de uma proteína, fornecendo uma indicação mensurável de ligação ao ligante⁶. A estabilidade térmica de uma proteína pode ser medida usando Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF), também conhecida como Thermofluor, ou Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. No TSA, uma amostra de proteína é submetida a temperaturas crescentes na presença de um corante ambientalmente sensível⁶. À medida que a proteína se desdobra e se desnatura, o corante se liga às regiões hidrofóbicas expostas da proteína e emite fluorescência. Os corantes fluorescentes extrínsecos, ou corantes ambientalmente sensíveis, carecem de fluorescência intrínseca e, em vez disso, fluorescem ao interagir com sua molécula-alvo ^9,11,12. O corante mais comumente usado, SYPRO Orange, oferece várias vantagens, como maior estabilidade e fluorescência de fundo mínima ^8,9,12. Notavelmente, o SYPRO Orange é compatível com sistemas de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) devido aos seus comprimentos de onda de excitação e emissão em torno de 470 nm e 570 nm, respectivamente. Esse recurso exclusivo permite medições de alto rendimento, precisas e sensíveis que são compatíveis com os sistemas de detecção de fluorescência comumente usados em sistemas RT-PCR⁸.

O TSA é uma ferramenta versátil para investigar interações proteicas com potenciais cofatores ou drogas e para identificar condições estabilizadoras para cristalografia. Algumas de suas vantagens sobre outros métodos de triagem são sua relativa simplicidade de configuração e alto rendimento com placas de 96 ou 384 poços 13,14,15. O desenvolvimento dessa técnica tem sido transformador para estudos de descoberta de fármacos, oferecendo conveniência e possibilitando o estudo de diversos aditivos, como íons, ligantes e fármacos ^6,16. Além disso, a adaptabilidade do TSA encorajou os cientistas a expandir sua utilidade, facilitando a medição das afinidades de ligação ao lado dos ensaios de triagem^17,18. A TSA é uma ferramenta eficaz em estudos de biologia estrutural para identificar condições que promovam a estabilização da proteína de interesse para cristalização¹⁹. Assim, sua flexibilidade e relativa facilidade posicionaram a TSA como uma técnica fundamental na caracterização de proteínas. Aqui, usaremos TSA para analisar a ligação de metais e nucleotídeos à pseudoquinase pouco estudada, Selenoproteína O (SelO), como exemplo.

As quinases são uma das famílias de proteínas mais visadas na descoberta de medicamentos²⁰. Prevê-se que aproximadamente 10% das quinases humanas sejam inativas e denominadas pseudoquinases porque não possuem os principais resíduos catalíticos necessários para a catálise^21,22. A selenoproteína O (SelO) é uma pseudoquinase evolutivamente conservada que não possui o aspartato conservado no motivo catalítico HRD²³. Em eucariotos, o SelO localiza-se nas mitocôndrias e protege as células do estresse oxidativo^24,25. Análises estruturais e bioquímicas mostram que o SelO transfere monofosfato de adenosina (AMP) do ATP para substratos proteicos em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação²⁵. Estudos recentes indicam que enzimas que catalisam a AMPilação podem se ligar a nucleotídeos alternativos, como UTP in vitro^26,27. Notavelmente, estudos demonstraram que o homólogo SelO de Salmonella typhimurium catalisa a proteína UMPilação, ou a transferência de UMP, de maneira dependente de manganês²⁸. Dadas essas observações intrigantes, testamos a ligação de SelO a ATP e UTP na presença de magnésio e manganês, servindo como um exemplo representativo das aplicações da TSA. O protocolo a seguir pode ser prontamente adaptado para otimizar e examinar as interações de outras proteínas e aditivos de interesse.