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Abstract
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Biochimie

Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

Published: August 09, 2024
doi:
10.3791/67139
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,
1Department of Physiology,University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Nous présentons ici le test de décalage thermique, une technique à haut débit basée sur la fluorescence utilisée pour étudier la liaison de petites molécules aux protéines d’intérêt.

Abstract

La définition de l’importance biologique des protéines aux fonctions inconnues constitue un obstacle important à la compréhension des processus cellulaires. Bien que les prédictions bioinformatiques et structurales aient contribué à l’étude de protéines inconnues, les validations expérimentales in vitro sont souvent entravées par les conditions optimales et les cofacteurs nécessaires à l’activité biochimique. La liaison des cofacteurs est non seulement essentielle à l’activité de certaines enzymes, mais peut également améliorer la stabilité thermique de la protéine. Une application pratique de ce phénomène consiste à utiliser le changement de stabilité thermique, mesuré par les altérations de la température de fusion de la protéine, pour sonder la liaison du ligand.

Le test de décalage thermique (TSA) peut être utilisé pour analyser la liaison de différents ligands à la protéine d’intérêt ou trouver une condition stabilisatrice pour réaliser des expériences telles que la cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrirons un protocole pour la TSA utilisant la pseudokinase, la sélénoprotéine O (SelO), pour une méthode simple et à haut débit pour tester la liaison des métaux et des nucléotides. Contrairement aux kinases canoniques, SelO se lie à l’ATP dans une orientation inversée pour catalyser le transfert de l’AMP vers les chaînes latérales hydroxyles des protéines dans une modification post-traductionnelle connue sous le nom d’AMPylation de la protéine. En tirant parti du changement des températures de fusion, nous fournissons des informations cruciales sur les interactions moléculaires sous-jacentes à la fonction SelO.

Introduction

Une grande partie du protéome humain reste mal caractérisée. L’« effet de lumière publique » décrit par Dunham et Kustatscher et al. fait référence au phénomène où les protéines largement étudiées reçoivent plus d’attention, laissant les protéines sous-étudiées négligées 1,2. Les facteurs contribuant à cet effet comprennent l’importance biologique et la pertinence de certaines protéines pour la maladie. De plus, les recherches antérieures qui offrent des connaissances fondamentales, ainsi que la disponibilité d’outils pour l’analyse fonctionnelle, stimulent davantage la recherche sur les protéines 1,2 très étudiées. Des projets tels que l’Initiative sur les protéines sous-étudiées, le Consortium en génomique structurale et l’Initiative sur la fonction enzymatique visent à caractériser les protéines sous-étudiées à l’aide de la protéomique structurale et fonctionnelle 2,3,4. Une approche complémentaire pour identifier les fonctions moléculaires des protéines sous-étudiées consiste à examiner les interactions de ces protéines avec de petites molécules afin d’obtenir des informations précieuses sur la régulation et la spécificité du substrat.

La liaison de petites molécules peut augmenter la stabilité thermique d’une protéine5. Ce phénomène, connu sous le nom de stabilisation de conformation induite par le ligand, entraîne souvent une augmentation de la température de fusion d’une protéine, fournissant une indication mesurable de la liaison du ligand6. La stabilité thermique d’une protéine peut être mesurée à l’aide de la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), également connue sous le nom de thermofluor, ou du test de décalage thermique (TSA)7,8,9,10. Dans la TSA, un échantillon de protéine est soumis à des températures croissantes en présence d’un colorant sensible à l’environnement6. Au fur et à mesure que la protéine se déploie et se dénature, le colorant se lie aux régions hydrophobes exposées de la protéine et émet une fluorescence. Les colorants fluorescents extrinsèques, ou colorants sensibles à l’environnement, n’ont pas de fluorescence intrinsèque et deviennent fluorescents lors de l’interaction avec leur molécule cible 9,11,12. Le colorant le plus couramment utilisé, SYPRO Orange, offre plusieurs avantages tels qu’une stabilité accrue et une fluorescence de fond minimale 8,9,12. Notamment, SYPRO Orange est compatible avec les systèmes de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) compte tenu de ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission d’environ 470 nm et 570 nm, respectivement. Cette caractéristique unique permet d’obtenir des mesures à haut débit, précises et sensibles, compatibles avec les systèmes de détection de fluorescence couramment utilisés dans les systèmes RT-PCR8.

La TSA est un outil polyvalent pour étudier les interactions des protéines avec des cofacteurs ou des médicaments potentiels et pour identifier les conditions stabilisatrices de la cristallographie. Certains de ses avantages par rapport aux autres méthodes de criblage sont sa relative simplicité de configuration et son débit élevé avec des plaques de 96 ou 384 puits 13,14,15. Le développement de cette technique a transformé les études de découverte de médicaments, offrant une commodité et permettant l’étude de divers additifs tels que les ions, les ligands et les médicaments 6,16. De plus, l’adaptabilité de la TSA a encouragé les scientifiques à étendre son utilité, facilitant la mesure des affinités de liaison parallèlement aux tests de dépistage17,18. La TSA est un outil efficace dans les études de biologie structurale pour identifier les conditions qui favorisent la stabilisation de la protéine d’intérêt pour la cristallisation19. Ainsi, sa flexibilité et sa relative facilité ont positionné la TSA comme une technique fondamentale dans la caractérisation des protéines. Ici, nous utiliserons la TSA pour analyser la liaison des métaux et des nucléotides à la pseudokinase sous-étudiée, la sélénoprotéine O (SelO), à titre d’exemple.

Les kinases sont l’une des familles de protéines les plus ciblées dans la découverte de médicaments20. Environ 10 % des kinases humaines sont prédites comme étant inactives et appelées pseudokinases parce qu’elles manquent de résidus catalytiques clés nécessaires à la catalyse21,22. La sélénoprotéine O (SelO) est une pseudokinase conservée au cours de l’évolution qui n’a pas l’aspartate conservé dans le motif catalytique HRD23. Chez les eucaryotes, SelO se localise dans les mitochondries et protège les cellules du stress oxydatif24,25. Les analyses structurales et biochimiques montrent que SelO transfère l’adénosine monophosphate (AMP) de l’ATP aux substrats protéiques dans une modification post-traductionnelle connue sous le nom d’AMPylation25. Des études récentes indiquent que les enzymes qui catalysent l’AMPylation peuvent se lier à d’autres nucléotides tels que l’UTP in vitro 26,27. Notamment, des études ont démontré que l’homologue SelO de Salmonella typhimurium catalyse la protéine UMPylation, ou le transfert d’UMP, de manière dépendante du manganèse28. Compte tenu de ces observations intrigantes, nous testons la liaison de SelO à l’ATP et à l’UTP en présence de magnésium et de manganèse, servant d’exemple représentatif des applications de la TSA. Le protocole suivant peut être facilement adapté pour optimiser et examiner les interactions d’autres protéines et additifs d’intérêt.

Protocol

1. Dispositif expérimental Utilisez un thermocycleur capable de détecter la fluorescence, tel qu’un instrument RT-PCR, pour exécuter le protocole décrit. Si vous utilisez SYPRO Orange, comme décrit dans ce protocole, utilisez un mode de balayage qui permet une excitation autour de 470 nm et une détection d’émission autour de 570 nm. Programmez le thermocycleur pour qu’il maintienne l’échantillon à 20 °C pendant 2 min, suivi d’une augmentation de la température de 0,5 °C/1 min jusqu’à 95 °C ; mesurer l’intensité de la fluorescence tous les 1 °C.REMARQUE : nous recommandons une étape facultative à la fin du cycle pour ramener le bloc d’échantillon à 20 °C (Figure 1). Chaque réaction contient quatre composants : tampon, protéine d’intérêt, additif et colorant fluorescent extrinsèque. Concevez l’expérience de manière à ce qu’elle comprenne des contrôles tels que l’absence de protéines, l’absence de colorants, les protéines sans additifs et les additifs seuls afin de déterminer toute fluorescence de fond susceptible d’influencer l’interprétation des résultats. Si disponible, incluez un témoin positif tel qu’un additif connu pour lier et stabiliser la protéine d’intérêt. Utilisez des protéines purifiées pour le dosage. Pour suivre cet exemple, utilisez E. coli SelO, exprimé et purifié comme décrit précédemment25,29. En bref, exprimez SelO (E. coli SelO ppSumo) marqué His-sumo dans les cellules Rosetta DE3 et purifiez-le en utilisant l’affinité Ni2+-NTA. Couvrez l’étiquette His-sumo à l’aide de la protéase Ulp et purifiez davantage SelO par chromatographie par filtration sur gel. La fluorescence de SYPRO Orange va dépendre de son interaction avec la protéine d’intérêt. Comme ces interactions varieront d’une protéine à l’autre, optimisez la concentration en protéines et en colorants pour obtenir le rapport signal/bruit maximal du signal de fluorescence.REMARQUE : SYPRO Orange n’est pas compatible avec certaines protéines et additifs tels que les détergents11,30. Les colorants extrinsèques supplémentaires énumérés au point 12 peuvent être examinés au besoin. 2. Détermination de la concentration optimale de colorant (Figure 2A) Préparez des dilutions de 20 μL de SYPRO Orange 50x, 40x, 30x, 20x et 10x à partir de la solution mère, qui est fournie à 5 000x dans le DMSO. Distribuer 8 μL de protéine 6,25 μM diluée dans un tampon TSA dans six puits distincts d’une plaque PCR de 384 puits.REMARQUE : Dans notre exemple, nous avons utilisé le tampon TSA suivant pour effectuer les dilutions : 10 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl et 1 mM de DTT. Les échantillons peuvent être analysés en trois exemplaires pour améliorer la fiabilité des résultats. Ajouter 1 μL de tampon TSA dans chaque puits.REMARQUE : Ce volume de tampon sera remplacé par l’ajout de petites molécules après optimisation de la concentration du colorant et des protéines. Ajouter 1 μL de chaque dilution en série de la solution de colorant SYPRO Orange dans chaque puits. Ajouter 1 μL de tampon sans colorant dans le puits final pour le contrôle sans colorant. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1. 3. Détermination de la concentration optimale en protéines (Figure 2B) Préparez 20 μL de dilutions en série de 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM et 1,56 μM de protéines à l’aide d’un tampon TSA (10 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl et 1 mM de DTT). Distribuer 8 μL de dilutions en série de la protéine dans cinq puits séparés d’une plaque de 384 puits. Distribuer le tampon uniquement dans le 6èmepuits comme un contrôle sans protéines. Ajouter 1 μL de tampon TSA dans chaque puits.REMARQUE : Ce volume de tampon sera remplacé par l’ajout de petites molécules après optimisation de la concentration du colorant et des protéines. Ajouter 1 μL de chaque solution de colorant SYPRO Orange 50x dans chaque puits. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1. 4. Mise en place d’une expérience TSA (Figure 3A) REMARQUE : Après optimisation des concentrations de protéines et de colorant SYPRO Orange, le test peut être effectué avec l’ajout des petites molécules souhaitées pour analyser la liaison. Définir le nombre de conditions en tenant compte des répétitions et des contrôles adéquats.REMARQUE : Par exemple, nous allons tester la liaison de SelO à huit conditions en trois exemplaires. En incluant les contrôles (pas d’additif, pas de protéine et pas de colorant), nous avons 11 réactions x 3 (en trois exemplaires) = 33 réactions au total. Sur la base de la concentration optimale de protéines et de colorants observée pour SelO, assurez-vous que chaque réaction contient 8 μL de protéine 6,25 μM, 1 μL d’additif et 1 μL de colorant SYPRO Orange 50x pour un volume de réaction total de 10 μL. Ainsi, la concentration finale utilisée est de 5 μM de protéine et de 5x SYPRO Orange. Préparez 288 μL de solution protéique de 6,25 μM à l’aide d’un tampon TSA. Ce volume de solution de travail protéique représente 36 réactions (33 réactions avec 10% supplémentaires pour les variations de pipetage). Distribuez 8 μL de protéine 6,25 μM dans des puits séparés d’une plaque de 384 puits. Distribuez le tampon uniquement pour le contrôle sans protéines. Ajoutez 1 μL de petites molécules à une concentration de 10x pour obtenir le 1x final. Pour suivre cet exemple, ajoutez 1 μL de 20 mM de MgCl2 pour obtenir une concentration finale de 2 mM. Distributeur de tampon uniquement pour le contrôle sans additif. Ajouter 1 μL de chaque solution de colorant SYPRO Orange 50x dans chaque puits. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1. 5. Analyse des données Exporter les données de la machine RT-PCR pour les unités de fluorescence relative (RFU) par rapport à la température (°C). Utilisez le logiciel de votre choix pour extraire et tracer des points de données jusqu’à l’intensité la plus élevée mesurée pour chaque courbe de fusion. Il est important de noter que les témoins sans protéine et sans colorant présentent une faible fluorescence de fond sans augmentation de la fluorescence dépendante de la température (figures 3A, B et tableau supplémentaire S1). Effectuez l’analyse de données à l’aide de logiciels librement accessibles tels que MoltenProt31 ou DSFWorld32. Déterminez la température de fusion à l’aide de l’ajustement sigmoïdal de Boltzmann pour les données. La température de fusion (Tm) est définie comme la température à laquelle une dénaturation de 50 % ou une intensité mi-maximale est observée (Figure 3C). Un décalage thermique dans la courbe de fusion peut suggérer des additifs stabilisants ou déstabilisants. Pour calculer la variation de la température de fusion (Tm), utilisez la formule : Tm = Tm additif- Tm tampon. Une valeur positive décrit une condition stabilisatrice ou un additif en interaction ; une valeur négative décrit une condition déstabilisante (figure 3D).

Representative Results

SelO eucaryote se compose d’une séquence de ciblage mitochondrial N-terminal, d’un domaine de type kinase et d’une sélénocystéine hautement conservée à l’extrémité C-terminale de la protéine23. Cette enzyme mitochondriale code pour un domaine pseudokinase qui est conservé des bactéries à l’homme23. L’analyse structurale de l’homologue SelO de Pseudomonas syringae a révélé des altérations des acides ami…

Discussion

Le test de décalage thermique (TSA) est une méthode efficace pour cribler les interactions protéine-ligand, y compris celles avec des cofacteurs et des inhibiteurs. Dans ce protocole, nous avons utilisé la TSA pour mesurer la liaison de la pseudokinase SelO aux nucléotides et aux cations divalents. Nos résultats montrent que SelO présente une stabilité thermique accrue en présence d’ATP et de Mg2+/Mn2+. Cette observation s’aligne sur des rapports antér…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.S. est titulaire d’une bourse W.W. Caruth, Jr. en recherche biomédicale, de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas (CPRIT) et d’une bourse du Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism et de la faculté de recherche clinique. Ce travail a été soutenu par NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) et Welch (I-2046-20230405).

Materials

Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383-10G used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly Beckman Coulter C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system Bio-Rad 12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white Bio-Rad HSP3805
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M8266-100G used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate Sigma Aldrich M3634-500G used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain Sigma Aldrich S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate Sigma Aldrich U6625-100MG used for representative results but not required to perfom TSA
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References

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Thermal Shift AssaySelenoprotein OSubstrate BindingCofactor BindingThermal StabilityLigand BindingProtein AMPylationX-ray CrystallographyPseudokinaseBiological ImportanceExperimental ValidationMelting Temperature

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Citer Cet Article
Gonzalez, A., Sreelatha, A. Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O. J. Vis. Exp. (210), e67139, doi:10.3791/67139 (2024).
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