استخدام مقايسة التحول الحراري لفحص ارتباط الركيزة بالسيلينوبروتين O
Summary
هنا ، نقدم مقايسة التحول الحراري ، وهي تقنية عالية الإنتاجية قائمة على التألق تستخدم للتحقيق في ارتباط الجزيئات الصغيرة بالبروتينات ذات الأهمية.
Abstract
يشكل تحديد الأهمية البيولوجية للبروتينات ذات الوظائف غير المعروفة عقبة كبيرة في فهم العمليات الخلوية. على الرغم من أن التنبؤات المعلوماتية الحيوية والهيكلية قد ساهمت في دراسة البروتينات غير المعروفة ، إلا أن عمليات التحقق من الصحة التجريبية في المختبر غالبا ما تعوقها الظروف المثلى والعوامل المساعدة اللازمة للنشاط الكيميائي الحيوي. ارتباط العامل المساعد ليس ضروريا فقط لنشاط بعض الإنزيمات ولكنه قد يعزز أيضا الاستقرار الحراري للبروتين. يكمن أحد التطبيقات العملية لهذه الظاهرة في الاستفادة من التغير في الاستقرار الحراري ، كما تم قياسه من خلال التغيرات في درجة حرارة انصهار البروتين ، لاستكشاف ارتباط الليجند.
يمكن استخدام مقايسة التحول الحراري (TSA) لتحليل ارتباط الروابط المختلفة بالبروتين محل الاهتمام أو إيجاد حالة استقرار لإجراء تجارب مثل علم البلورات بالأشعة السينية. سنصف هنا بروتوكولا ل TSA باستخدام السودوكيناز ، Selenoprotein O (SelO) ، للحصول على طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لاختبار ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات. على عكس الكينازات المتعارف عليها ، يربط SelO ATP في اتجاه مقلوب لتحفيز نقل AMP إلى سلاسل الهيدروكسيل الجانبية للبروتينات في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم البروتين AMPylation. من خلال الاستفادة من التحول في درجات حرارة الانصهار ، نقدم رؤى مهمة حول التفاعلات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة SelO.
Introduction
لا يزال الكثير من البروتينات البشرية ضعيف التوصيف. يشير “تأثير ضوء الشارع” الذي وصفه دنهام وكوستاتشر وآخرون إلى الظاهرة التي تحظى فيها البروتينات التي تم بحثها على نطاق واسع بمزيد من الاهتمام ، تاركة البروتينات غير المدروسة يتم تجاهلها 1,2. تشمل العوامل التي تساهم في هذا التأثير الأهمية البيولوجية وأهمية المرض لبعض البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن الأبحاث السابقة التي تقدم المعرفة الأساسية ، فضلا عن توفر أدوات للتحليل الوظيفي ، تحفز البحث في البروتينات المدروسةللغاية 1,2. تهدف مشاريع مثل مبادرة البروتينات غير المدروسة ، واتحاد الجينوم الهيكلي ، ومبادرة وظيفة الإنزيم إلى توصيف البروتينات غير المدروسة باستخدام البروتينات الهيكلية والوظيفية2،3،4. يتمثل النهج التكميلي لتحديد الوظائف الجزيئية للبروتينات غير المدروسة في فحص تفاعلات هذه البروتينات مع الجزيئات الصغيرة لاكتساب رؤى قيمة حول التنظيم وخصوصية الركيزة.
يمكن أن يؤدي ربط الجزيئات الصغيرة إلى زيادة الاستقرار الحراري للبروتين5. غالبا ما تؤدي هذه الظاهرة ، المعروفة باسم تثبيت التشكل الناجم عن الرباط ، إلى زيادة في درجة حرارة انصهار البروتين ، مما يوفر مؤشرا قابلا للقياس على ارتباط الرباط6. يمكن قياس الاستقرار الحراري للبروتين باستخدام المسح الضوئي التفاضلي (DSF) ، المعروف أيضا باسم Thermofluor ، أو مقايسة التحول الحراري (TSA) 7،8،9،10. في TSA ، تتعرض عينة البروتين لدرجات حرارة متزايدة في وجود صبغة حساسة بيئيا6. عندما يتكشف البروتين ويتشوه ، ترتبط الصبغة بالمناطق الكارهة للماء المكشوفة للبروتين وتنبعث منها مضان. تفتقر أصباغ الفلورسنت الخارجية ، أو الأصباغ الحساسة بيئيا ، إلى التألق الداخلي وبدلا من ذلك تتألق عند التفاعل مع جزيئها المستهدف9،11،12. توفر الصبغة الأكثر استخداما ، SYPRO Orange ، العديد من المزايا مثل الاستقرار المعزز والحد الأدنى من مضان الخلفية8،9،12. والجدير بالذكر أن SYPRO Orange متوافق مع أنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-PCR) نظرا لأطوال موجات الإثارة والانبعاث حوالي 470 نانومتر و 570 نانومتر على التوالي. تسمح هذه الميزة الفريدة بإجراء قياسات عالية الإنتاجية ودقيقة وحساسة متوافقة مع أنظمة الكشف عن التألق المستخدمة بشكل شائع في أنظمة RT-PCR8.
TSA هي أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات البروتين مع العوامل المساعدة أو الأدوية المحتملة ولتحديد ظروف الاستقرار لعلم البلورات. بعض مزاياها على طرق الفحص الأخرى هي بساطتها النسبية في الإعداد والإنتاجية العالية مع لوحات 96 أو 384 بئرا13،14،15. كان تطوير هذه التقنية تحويليا لدراسات اكتشاف الأدوية ، حيث يوفر الراحة ويتيح دراسة الإضافات المتنوعة مثل الأيونات والروابط والأدوية6،16. علاوة على ذلك ، شجعت قدرة TSA على التكيف العلماء على توسيع فائدتها ، مما يسهل قياس الصلات الملزمة جنبا إلى جنب مع فحوصات الفحص17,18. TSA هي أداة فعالة في دراسات البيولوجيا الهيكلية لتحديد الظروف التي تعزز استقرار البروتين محل الاهتمام للتبلور19. وبالتالي ، فإن مرونته وسهولته النسبية قد وضعت TSA كتقنية أساسية في توصيف البروتينات. هنا ، سوف نستخدم TSA لتحليل ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات بالسودوكيناز غير المدروس ، Selenoprotein O (SelO) ، كمثال.
Kinases هي واحدة من أكثر عائلات البروتين المستهدفة في اكتشاف الأدوية20. من المتوقع أن يكون ما يقرب من 10٪ من كينازات الإنسان غير نشط ويطلق عليه اسم pseudokinases لأنها تفتقر إلى المخلفات التحفيزية الرئيسية المطلوبة للحفز21,22. Selenoprotein O (SelO) هو سودوكيناز محفوظ تطوريا يفتقر إلى الأسبارتات المحفوظة في شكل HRD التحفيزي23. في حقيقيات النوى ، يتمركز SelO في الميتوكوندريا ويحمي الخلايا من الإجهاد التأكسدي24,25. تظهر التحليلات الهيكلية والكيميائية الحيوية أن SelO ينقل الأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) من ATP إلى ركائز البروتين في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم AMPylation25. تشير الدراسات الحديثة إلى أن الإنزيمات التي تحفز AMPylation قد تربط النيوكليوتيدات البديلة مثل UTP في المختبر26,27. والجدير بالذكر أن الدراسات أظهرت أن متماثل SelO من السالمونيلا التيفية يحفز البروتين UMPylation ، أو نقل UMP ، بطريقة تعتمد علىالمنغنيز 28. بالنظر إلى هذه الملاحظات المثيرة للاهتمام ، نختبر ارتباط SelO ب ATP و UTP في وجود المغنيسيوم والمنغنيز ، بمثابة مثال تمثيلي لتطبيقات TSA. يمكن تكييف البروتوكول التالي بسهولة لتحسين وفحص تفاعلات البروتينات والمواد المضافة الأخرى ذات الأهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل اختبار التحول الحراري (TSA) كطريقة فعالة لفحص تفاعلات البروتين والليجند ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على العوامل المساعدة والمثبطات. في هذا البروتوكول ، استخدمنا TSA لقياس ارتباط السودوكيناز SelO بالنيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. تظهر النتائج التي توصلنا إليه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
إيه إس هو باحث دبليو دبليو كاروث جونيور في الأبحاث الطبية الحيوية ، وباحث معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) ، ومركز تشارلز وجين باك لاستقلاب المعادن وباحث كلية البحوث السريرية. تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant K01DK123194 (AS) ، و CPRIT GRANT RR190106 (AS) ، و Welch (I-2046-20200401) و Welch (I-2046-20230405).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383-10G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Avanti J-15R with microplate carrier assembly | Beckman Coulter | C19416 | |
| CFX Opus 384 Real-time PCR system | Bio-Rad | 12011452 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3805 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | M3634-500G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| SYPRO Orange Protein Gel stain | Sigma Aldrich | S5692-500UL | |
| Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma Aldrich | U6625-100MG | used for representative results but not required to perfom TSA |
References
- Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
- Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
- Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19 (2014).
- Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018 (2023).
- Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
- Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-29 (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
- Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , (2023).
- Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688 (2023).
- Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
- Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
- Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
- Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
- Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650 (2019).
- Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), 51809 (2014).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
- Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894 (2024).
- Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
- Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
- Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138 (2012).
- Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518 (2014).
- Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821.e19 (2018).
- Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279 (2023).
- Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
- Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161 (2020).
- Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
- Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024 (2017).
- Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
- Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022 (2024).
- Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 2), 209-214 (2013).
- Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
- Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
- Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
- Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).
