Gebruik makend van thermische verschuivingstest om substraatbinding aan selenoproteïne O te sonden

Een groot deel van het menselijke proteoom blijft slecht gekarakteriseerd. Het door Dunham en Kustatscher et al. beschreven “straatlantaarneffect” verwijst naar het fenomeen waarbij uitgebreid onderzochte eiwitten meer aandacht krijgen, waardoor onderbelichte eiwitten over het hoofd worden gezien ^1,2. Factoren die bijdragen aan dit effect zijn onder meer het biologische belang en de relevantie voor de ziekte van bepaalde eiwitten. Bovendien stimuleert eerder onderzoek dat fundamentele kennis biedt, evenals de beschikbaarheid van instrumenten voor functionele analyse, het onderzoek naar hoogbestudeerde eiwitten verder ^1,2. Projecten zoals het Understudy Proteins Initiative, het Structural Genomics Consortium en het Enzyme Function Initiative hebben tot doel onderbestudeerde eiwitten te karakteriseren met behulp van structurele en functionele proteomics ^2,3,4. Een aanvullende benadering voor het identificeren van de moleculaire functies van onderbelichte eiwitten is het onderzoeken van de interacties van deze eiwitten met kleine moleculen om waardevolle inzichten te verkrijgen in de regulatie en substraatspecificiteit.

De binding van kleine moleculen kan de thermische stabiliteit van een eiwit verhogen⁵. Dit fenomeen, bekend als ligand-geïnduceerde conformatiestabilisatie, resulteert vaak in een verhoging van de smelttemperatuur van een eiwit, wat een meetbare indicatie geeft van ligandbinding⁶. De thermische stabiliteit van een eiwit kan worden gemeten met behulp van Differential Scanning Fluorimetry (DSF), ook bekend als Thermofluor, of Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. Bij TSA wordt een eiwitmonster blootgesteld aan stijgende temperaturen in aanwezigheid van een milieugevoelige kleurstof⁶. Terwijl het eiwit zich ontvouwt en denatureert, bindt de kleurstof zich aan de blootgestelde hydrofobe gebieden van het eiwit en zendt fluorescentie uit. Extrinsieke fluorescerende kleurstoffen, of milieugevoelige kleurstoffen, missen intrinsieke fluorescentie en fluoresceren in plaats daarvan bij interactie met hun doelmolecuul ^9,11,12. De meest gebruikte kleurstof, SYPRO Orange, biedt verschillende voordelen zoals verbeterde stabiliteit en minimale achtergrondfluorescentie ^8,9,12. SYPRO Orange is met name compatibel met Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)-systemen, gezien de excitatie- en emissiegolflengten rond respectievelijk 470 nm en 570 nm. Deze unieke functie maakt nauwkeurige en gevoelige metingen met een hoge doorvoer mogelijk die compatibel zijn met fluorescentiedetectiesystemen die vaak worden gebruikt in RT-PCR-systemen⁸.

TSA is een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoeken van eiwitinteracties met potentiële cofactoren of geneesmiddelen en voor het identificeren van stabiliserende omstandigheden voor kristallografie. Enkele van de voordelen ten opzichte van andere zeefmethoden zijn de relatieve eenvoud van installatie en de hoge doorvoer met platen met 96 of 384 putjes 13,14,15. De ontwikkeling van deze techniek is transformerend geweest voor studies naar het ontdekken van geneesmiddelen, biedt gemak en maakt de studie van diverse additieven zoals ionen, liganden en geneesmiddelen mogelijk ^6,16. Bovendien heeft het aanpassingsvermogen van TSA wetenschappers aangemoedigd om het nut ervan uit te breiden, waardoor het meten van bindingsaffiniteiten naast de screeningstests^17,18 wordt vergemakkelijkt. TSA is een effectief hulpmiddel in structurele biologiestudies om omstandigheden te identificeren die de stabilisatie van het eiwit dat van belang is voor kristallisatie bevorderen¹⁹. De flexibiliteit en het relatieve gemak hebben TSA dus gepositioneerd als een hoeksteentechniek bij het karakteriseren van eiwitten. Hier zullen we TSA gebruiken om de binding van metalen en nucleotide aan het onderbestudeerde pseudokinase, Selenoproteïne O (SelO), als voorbeeld te analyseren.

Kinasen zijn een van de meest gerichte eiwitfamilies bij de ontdekking van geneesmiddelen²⁰. Er wordt voorspeld dat ongeveer 10% van de menselijke kinasen inactief is en pseudokinasen wordt genoemd omdat ze belangrijke katalytische residuen missen die nodig zijn voor katalyse^21,22. Selenoproteïne O (SelO) is een evolutionair geconserveerd pseudokinase dat het geconserveerde aspartaat mist in het katalytische HRD-motief²³. In eukaryoten lokaliseert SelO zich in de mitochondriën en beschermt het cellen tegen oxidatieve stress ^24,25. Structurele en biochemische analyses tonen aan dat SelO adenosinemonofosfaat (AMP) overbrengt van ATP naar eiwitsubstraten in een posttranslationele modificatie die bekend staat als AMPylatie²⁵. Recente studies geven aan dat enzymen die AMPylatie katalyseren, alternatieve nucleotiden zoals UTP in vitro kunnen binden ^26,27. Studies hebben met name aangetoond dat de SelO-homoloog van Salmonella typhimurium eiwit-UMPylatie, of de overdracht van UMP, op een mangaanafhankelijke manier katalyseert²⁸. Gezien deze intrigerende waarnemingen testen we de binding van SelO aan ATP en UTP in aanwezigheid van magnesium en mangaan, en dienen we als een representatief voorbeeld van de toepassingen van TSA. Het volgende protocol kan gemakkelijk worden aangepast om de interacties van andere eiwitten en interessante additieven te optimaliseren en te onderzoeken.