Summary

Демонстрация мембранного транспорта гистидина с использованием инвертированных мешков в козьем кишечнике: экспериментальный педагогический инструмент для студентов бакалавриата

Published: October 04, 2024
doi:

Summary

В этой статье мы рассказываем о недорогом и воспроизводимом методе, демонстрирующем мембранный транспорт гистидина в кишечнике козы. Этот процесс происходит за счет совместного транспортирования ионов гистидина и натрия под действием градиента натрия через мембрану энтероцитов. Этот метод использует педагогику эмпирического обучения для лучшего понимания движения растворенных веществ через биологические мембраны.

Abstract

Гистидин является незаменимой аминокислотой, которая также является предшественником метаболитов, участвующих в иммунной системе, легочной вентиляции и сосудистом кровообращении. Абсорбция гистидина с пищей в значительной степени зависит от транспорта нейтральных аминокислот, связанного с натрием, транспортером нейтральных аминокислот Броуда (B0AT), присутствующим на апикальной мембране энтероцита. Здесь мы демонстрируем абсорбцию гистидина кишечными ворсинчатыми энтероцитами из просвета с использованием перевернутых мешочков тощей кишки козы. Тощищие мешочки, подвергшиеся воздействию различных концентраций натрия и гистидина, были проанализированы для определения концентрации гистидина внутри мешков в зависимости от времени. Результаты показывают активное всасывание гистидина. Увеличение концентрации соли приводило к более высокой абсорбции гистидина, что свидетельствует о симпорте абсорбции натрия и гистидина в инвертированных кишечных мешочках коз. Этот протокол может быть применен для визуализации подвижности аминокислот или других метаболитов в кишечнике с соответствующими модификациями. Мы предлагаем этот эксперимент в качестве экспериментального педагогического инструмента, который может помочь студентам бакалавриата понять концепцию мембранного транспорта.

Introduction

Биологические клетки окружены мембранным липидным бислоем, который отделяет внутриклеточный цитозоль от внеклеточного содержимого. Мембрана служит полупроницаемым барьером, регулирующим движение растворенных веществ1. На транспорт через биологические мембраны влияет коэффициент проницаемости растворенного вещества, который зависит от нескольких факторов, в том числе от концентрации и заряда растворенного вещества. В целом, растворенные вещества перемещаются через мембрану с помощью трех механизмов (рис. 1): пассивная диффузия, облегченная диффузия и активный транспорт2. Простая диффузия — это процесс, при котором растворимые, незаряженные и неполярные растворенные вещества пропускают градиент своей концентрации вниз по полупроницаемой мембране (рис. 1A). Мембранные белки не участвуют в этом процессе, поскольку он включает в себя перемещение растворенных веществ из области с более высокой концентрацией в область с более низкой концентрацией. Скорость диффузии основана на законе Фика3. С другой стороны, облегченная диффузия представляет собой белок-зависимый транспорт, при котором мембрана позволяет только селективным растворенным веществам проходить по градиенту концентрации без затрат энергии (рис. 1B). Этот вид транспорта специфичен и отличается от простой диффузии проявлением кинетики насыщения.

Активный транспорт представляет собой белок-зависимый транспорт молекул против градиента их концентрации, т.е. из области более низкой концентрации в область более высокой концентрации с использованием АТФ или ионных градиентов (рис. 1В). Когда транспортер гидролизует АТФ, этот транспорт называется первичным активным транспортом (рис. 1C; левая панель). Другой формой активного транспорта является вторичный активный транспорт (рис. 1C; правая панель). При вторичном активном транспорте растворенные вещества перемещаются на основе электрохимического градиента. Это происходит, когда белок-транспортер связывает движение иона (обычно Na+) вниз по градиенту концентрации с движением другой молекулы или иона против градиента концентрации. Этот вид движения растворенного вещества может быть совместным транспортом (Symport), при котором растворенное вещество и ион движутся в одном направлении, или обменом (Antiport), в этом случае растворенное вещество и ион движутся в противоположных направлениях.

Пищевые аминокислоты и моносахариды из пищевых источников всасываются в тонком кишечнике. Тонкую кишку можно функционально разделить на три сегмента: двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку (рис. 2). Всасывание растворенного вещества происходит по всему тонкому кишечнику, при этом максимальная абсорбция происходит в тощей кишке и на проксимальном конце подвздошной кишки. Кишечные энтероциты представляют собой поляризованные клетки, а плотные соединения, соединяющие две соседние клетки, создают два отдельных мембранных участка – базолатеральный и апикальный (рис. 2). Абсорбция люминальных растворенных веществ, образующихся в процессе пищеварения, происходит на участке апикальной мембраны4.

Транспорт гистидина в кишечных энтероцитах на апикальной мембране является примером вторичного активного симпорта, который зависит от натрия. На базолатеральном конце гистидин, поступающий в энтероцит, движется вниз по градиенту концентрации в печеночный портальный круг кровообращения. Внутриклеточные концентрации натрия в энтероците поддерживаются на уровне 12 ммоль/л1, что ниже внеклеточных/люминальных концентраций, что обусловлено активным выкачиванием натрия из клетки Na+ К+АТФазой, расположенной на базолатеральной мембране (рис. 3). На апикальной мембране энтероцитовB 0AT и натрий-нейтральный транспортер аминокислот (SNAT) 5 являются основными транспортерами, которые транспортируют не только гистидин, но и аминокислоты, такие как аспарагин и глутамин, в натрий-зависимом котранспорте 5,6. Другой транспортный белок, называемый Large Amino Acid Transporter (LAT)1, присутствующий на базолатеральной мембране энтероцитов, транспортирует через мембрану крупные нейтральные аминокислоты, такие как лейцин, триптофан, тирозин и фенилаланин.

С целью обучения концепции мембранного транспорта в сочетании с такими методами, как спектрофотометрия и рутинные биохимические анализы с помощью педагогики эмпирического обучения, крайне важно разработать методологии, которые могут не только продемонстрировать эту концепцию в простых для понимания терминах, но и обеспечить совместное обучение для студентов бакалавриата. В настоящее время у студентов есть ограниченные ресурсы для практического участия в изучении таких концепций биохимии. В этой статье мы представляем простой протокол для демонстрации транспорта гистидина через мембрану кишечника козы, который легко воспроизвести в студенческих лабораториях и который может быть адаптирован для оценки транспорта других метаболитов. Что еще более важно, метод использует недорогие материалы в студенческой лаборатории, тем самым обеспечивая экспериментальное обучение даже в самых простых лабораторных условиях.

Protocol

Весь протокол со всеми этапами представлен в виде схематической диаграммы на рисунке 4. Метод адаптирован из предыдущего исследования с использованием кишечника крысы8. Эксперимент проводился в соответствии с институциональными рекомен…

Representative Results

Экспериментальный процесс демонстрации кишечной подвижности гистидина путем абсорбции гистидина кишечными ворсинками в просвет вывернутых мешочков проиллюстрирован на рисунках 4, в таблице 1 и таблице 2. Были выполнены три независ?…

Discussion

Мембранный транспорт является одним из самых фундаментальных понятий, которые преподаются студентам бакалавриата по всем основным дисциплинам биологических наук, как фундаментальным, так и прикладным. Традиционно движение по мембранам визуализировалось с помощью …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано кафедрой биохимии Колледжа Шри Венкатешвара Делийского университета. Авторы благодарят сотрудников лаборатории за поддержку.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes TARSONS 500020
10 mL Test Tubes BOROSIL 9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes TARSONS 546041
500 mL Beaker BOROSIL 10044977
500 mL Conical Flask BOROSIL 691467
D-Glucose SRL 42738
Digital Spectrophotometer SYSTRONICS 2710
Ethanol EMSURE 1009831000
Finpipettes THERMOFISHER 4642090
Glass Stirrer Rod BOROSIL 9850107
L-Histidine  SRL 17849
NaCl SRL 41721
Nitrile Gloves KIMTECH 112-4847
Petri Dish  TARSONS 460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) SRL 95131
Pipette Tips ABDOS P10102
Sodium Carbonate SRL 89382
Sodium Nitrate  SRL 44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) SRL 53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) SRL 22249
Sulphanilic Acid  SRL 15354

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger Principles of Biochemistry. , (2017).
  2. Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , (2013).
  3. Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
  4. Sherwood, L. . Introduction to Human Physiology. , (2013).
  5. Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
  6. Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
  7. Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
  8. Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA – Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
  9. Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins: I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
  10. Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
  11. Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
  12. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  13. Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
  14. Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630 (2022).

Play Video

Cite This Article
Haris, H., Kumar, P., Bhardwaj, V., Taritla, S., Malhotra, V., Narayanasamy, N. Demonstration of Membrane Transport of Histidine using Goat Intestinal Inverted Sacs: An Experiential Pedagogical Tool for Undergraduates. J. Vis. Exp. (212), e66882, doi:10.3791/66882 (2024).

View Video