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Démonstration du transport membranaire de l’histidine à l’aide de sacs inversés intestinaux de chèvre : un outil pédagogique expérientiel pour les étudiants de premier cycle

Published: October 04, 2024
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Summary

Ici, nous rapportons une méthode peu coûteuse et reproductible démontrant le transport membranaire de l’histidine dans un intestin de chèvre. Ce processus se produit en co-transportant les ions histidine et sodium activés par le gradient de sodium à travers la membrane entérocytaire. Cette méthode exploite la pédagogie de l’apprentissage par l’expérience pour mieux comprendre le mouvement des solutés à travers les membranes biologiques.

Abstract

L’histidine est un acide aminé essentiel qui est également un précurseur des métabolites impliqués dans le système immunitaire, la ventilation pulmonaire et la circulation vasculaire. L’absorption de l’histidine alimentaire repose en grande partie sur le transport d’acides aminés neutres couplé au sodium par le transporteur d’acides aminés neutres larges (B0AT) présent sur la membrane apicale de l’entérocyte. Ici, nous démontrons l’absorption de l’histidine par les entérocytes des villosités intestinales à partir de la lumière à l’aide de sacs inversés jéjunaux de chèvre. Les sacs jéjunaux exposés à des concentrations variables de sodium et d’histidine ont été dosés pour déterminer la concentration d’histidine à l’intérieur des sacs en fonction du temps. Les résultats montrent une absorption active de l’histidine. L’augmentation de la concentration de sel a entraîné une absorption plus élevée de l’histidine, ce qui suggère un symptôme de l’absorption du sodium et de l’histidine dans les sacs inversés intestinaux de chèvre. Ce protocole peut être appliqué pour visualiser la mobilité intestinale des acides aminés ou d’autres métabolites avec les modifications appropriées. Nous proposons cette expérience comme un outil pédagogique expérientiel qui peut aider les étudiants de premier cycle à comprendre le concept de transport membranaire.

Introduction

Les cellules biologiques sont entourées d’une bicouche lipidique membranaire qui sépare le cytosol intracellulaire du contenu extracellulaire. La membrane sert de barrière semi-perméable qui régule le mouvement des solutés1. Le transport à travers les membranes biologiques est affecté par le coefficient de perméabilité d’un soluté, qui dépend de plusieurs facteurs, dont la concentration et la charge du soluté. En général, les solutés se déplacent à travers la membrane en utilisant trois mécanismes (Figure 1) : la diffusion passive, la diffusion facilitée et le transport actif2. La diffusion simple est le processus par lequel les solutés solubles, non chargés et non polaires passent leur gradient de concentration à travers une membrane semi-perméable (Figure 1A). Les protéines membranaires n’aident pas à ce processus car il implique le mouvement des solutés d’une région de concentration plus élevée vers une région de concentration plus faible. Le taux de diffusion est basé sur la loi de Fick3. D’autre part, la diffusion facilitée est un transport dépendant des protéines dans lequel la membrane ne laisse passer que des solutés sélectifs le long d’un gradient de concentration sans dépense d’énergie (Figure 1B). Ce type de transport est spécifique et diffère de la simple diffusion en présentant une cinétique de saturation.

Le transport actif est un transport dépendant des protéines de molécules contre leur gradient de concentration, c’est-à-dire de la région de concentration la plus faible à une région de concentration plus élevée avec l’utilisation de gradients d’ATP ou d’ions (Figure 1C). Lorsque le transporteur hydrolyse l’ATP, le transport est appelé transport actif primaire (Figure 1C ; panneau de gauche). Une autre forme de transport actif est le transport actif secondaire (Figure 1C ; panneau de droite). Dans le transport actif secondaire, les solutés sont déplacés en fonction d’un gradient électrochimique. Elle se produit lorsqu’une protéine de transport couple le mouvement d’un ion (généralement Na+) le long de son gradient de concentration avec le mouvement d’une autre molécule ou d’un ion contre son gradient de concentration. Ce type de mouvement de soluté peut être un co-transport (Symport) dans lequel le soluté et l’ion se déplacent dans la même direction ou un échange (Antiport), auquel cas le soluté et l’ion se déplacent dans des directions opposées.

Les acides aminés alimentaires et les monosaccharides provenant de sources alimentaires sont absorbés dans l’intestin grêle. L’intestin grêle peut être fonctionnellement divisé en trois segments : le duodénum, le jéjunum et l’iléon (figure 2). L’absorption du soluté se produit dans tout l’intestin grêle, l’absorption maximale se produisant au niveau du jéjunum et de l’extrémité proximale de l’iléon. Les entérocytes intestinaux sont des cellules polarisées, et les jonctions serrées reliant deux cellules adjacentes créent deux sites membranaires distincts – le site de membrane basolatérale et le site de membrane apicale (Figure 2). L’absorption des solutés luminaux générés par la digestion se produit sur le site de la membrane apicale4.

Le transport de l’histidine dans les entérocytes intestinaux au niveau de la membrane apicale est un exemple de symport actif secondaire dépendant du sodium. À l’extrémité basolatérale, l’histidine entrant dans l’entérocyte descend le gradient de concentration dans la circulation porte hépatique. Les concentrations intracellulaires de sodium dans l’entérocyte sont maintenues à 12 mmoles/L1, ce qui est inférieur aux concentrations extracellulaires/luminales, en raison du pompage actif du sodium hors de la cellule par la Na+ K+ATPase située sur la membrane basolatérale (Figure 3). Au niveau de la membrane apicale des entérocytes, le B0AT et le transporteur d’acides aminés neutres en sodium (SNAT) 5 sont les principaux transporteurs qui transportent non seulement l’histidine, mais aussi des acides aminés tels que l’asparagine et la glutamine dans un cotransport dépendant du sodium 5,6. Une autre protéine de transport appelée Large Amino Acid Transporter (LAT)1 présente au niveau de la membrane basolatérale des entérocytes transporte de grands acides aminés neutres tels que la leucine, le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine à travers la membrane7.

Dans le but d’enseigner le concept de transport membranaire intégré à des techniques telles que la spectrophotométrie et les tests biochimiques de routine par le biais de la pédagogie de l’apprentissage par l’expérience, il est impératif de développer des méthodologies qui peuvent non seulement démontrer le concept en termes faciles à comprendre, mais aussi permettre un apprentissage participatif pour les étudiants de premier cycle. À l’heure actuelle, les ressources disponibles pour les étudiants sont limitées pour s’engager dans l’apprentissage de ces concepts de biochimie. Ici, nous rapportons un protocole simple pour démontrer le transport de l’histidine à travers la membrane intestinale de la chèvre qui est facile à reproduire dans les laboratoires de premier cycle et peut être adapté pour évaluer le transport d’autres métabolites également. Plus important encore, la méthode utilise des matériaux peu coûteux dans un laboratoire de premier cycle, permettant ainsi un apprentissage par l’expérience, même dans les contextes de laboratoire les plus simples.

Protocol

L’ensemble du protocole avec toutes les étapes est représenté par un schéma de principe à la figure 4. La méthode est adaptée d’une étude précédente utilisant des intestins de rat8. L’expérience a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès d’un vendeur commercial. ATTENTION : Portez des gants p…

Representative Results

Le flux de travail expérimental pour démontrer la mobilité intestinale de l’histidine par l’absorption de l’histidine par les villosités intestinales dans la lumière des sacs inversés est illustré à la figure 4, au tableau 1 et au tableau 2. Trois montages expérimentaux indépendants ont été réalisés, et des données représentatives sont présentées à la figure 6. <p cl…

Discussion

Le transport membranaire est l’un des concepts les plus fondamentaux enseignés aux étudiants de premier cycle de toutes les principales disciplines des sciences biologiques, fondamentales ou appliquées. Traditionnellement, le mouvement à travers les membranes a été visualisé à l’aide de métabolites marqués avec des isotopes radioactifs. Cependant, ces méthodes sont extrêmement dangereuses et ne sont pas réalisables pour l’enseignement ou l’apprentissage. Bien que l?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par le Département de biochimie du Sri Venkateswara College de l’Université de Delhi. Les auteurs remercient le personnel du laboratoire pour leur soutien.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes TARSONS 500020
10 mL Test Tubes BOROSIL 9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes TARSONS 546041
500 mL Beaker BOROSIL 10044977
500 mL Conical Flask BOROSIL 691467
D-Glucose SRL 42738
Digital Spectrophotometer SYSTRONICS 2710
Ethanol EMSURE 1009831000
Finpipettes THERMOFISHER 4642090
Glass Stirrer Rod BOROSIL 9850107
L-Histidine  SRL 17849
NaCl SRL 41721
Nitrile Gloves KIMTECH 112-4847
Petri Dish  TARSONS 460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) SRL 95131
Pipette Tips ABDOS P10102
Sodium Carbonate SRL 89382
Sodium Nitrate  SRL 44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) SRL 53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) SRL 22249
Sulphanilic Acid  SRL 15354

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger Principles of Biochemistry. , (2017).
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Cite This Article
Haris, H., Kumar, P., Bhardwaj, V., Taritla, S., Malhotra, V., Narayanasamy, N. Demonstration of Membrane Transport of Histidine using Goat Intestinal Inverted Sacs: An Experiential Pedagogical Tool for Undergraduates. J. Vis. Exp. (212), e66882, doi:10.3791/66882 (2024).

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