Demonstration des Membrantransports von Histidin unter Verwendung von invertierten Beuteln aus dem Ziegendarm: Ein erfahrungspädagogisches Werkzeug für Studenten

Biologische Zellen sind von einer Membran-Lipid-Doppelschicht umgeben, die das intrazelluläre Zytosol vom extrazellulären Inhalt trennt. Die Membran dient als semipermeable Barriere, die die Bewegung der gelösten Stoffe¹ reguliert. Der Transport durch biologische Membranen wird durch den Permeabilitätskoeffizienten eines gelösten Stoffes beeinflusst, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der Konzentration und Ladung des gelösten Stoffes. Im Allgemeinen bewegen sich gelöste Stoffe durch die Membran mit drei Mechanismen (Abbildung 1): Passive Diffusion, erleichterte Diffusion und aktiver Transport². Einfache Diffusion ist der Prozess, bei dem lösliche, ungeladene und unpolare gelöste Stoffe ihren Konzentrationsgradienten durch eine semipermeable Membran passieren (Abbildung 1A). Membranproteine unterstützen diesen Prozess nicht, da er die Bewegung von gelösten Stoffen von einem Bereich höherer Konzentration in einen Bereich mit niedrigerer Konzentration beinhaltet. Die Diffusionsrate basiert auf dem Fickschen Gesetz³. Auf der anderen Seite ist die erleichterte Diffusion ein proteinabhängiger Transport, bei dem die Membran nur selektive gelöste Stoffe ohne Energieaufwand entlang eines Konzentrationsgradienten passieren lässt (Abbildung 1B). Diese Art des Transports ist spezifisch und unterscheidet sich von der einfachen Diffusion durch die Sättigungskinetik.

Aktiver Transport ist ein proteinabhängiger Transport von Molekülen gegen ihren Konzentrationsgradienten, d.h. vom Bereich niedrigerer Konzentration in einen Bereich höherer Konzentration unter Verwendung von ATP- oder Ionengradienten (Abbildung 1C). Wenn der Transporter ATP hydrolysiert, wird der Transport als primärer aktiver Transport bezeichnet (Abbildung 1C; linkes Bild). Eine andere Form des aktiven Transports ist der sekundäre aktive Transport (Abbildung 1C; rechtes Bild). Beim sekundären aktiven Transport werden gelöste Stoffe auf der Grundlage eines elektrochemischen Gradienten bewegt. Sie findet statt, wenn ein Transporterprotein die Bewegung eines Ions (typischerweise Na⁺) entlang seines Konzentrationsgradienten mit der Bewegung eines anderen Moleküls oder eines Ions gegen seinen Konzentrationsgradienten koppelt. Diese Art der Bewegung des gelösten Stoffes kann ein Mittransport (Symport) sein, bei dem sich sowohl der gelöste Stoff als auch das Ion in die gleiche Richtung bewegen, oder ein Austausch (Antiport), in welchem Fall sich der gelöste Stoff und das Ion in entgegengesetzte Richtungen bewegen.

Die Aminosäuren und Monosaccharide aus der Nahrung werden im Dünndarm aufgenommen. Der Dünndarm kann funktionell in drei Segmente unterteilt werden: Duodenum, Jejunum und Ileum (Abbildung 2). Die Resorption des gelösten Stoffes erfolgt im gesamten Dünndarm, wobei die maximale Resorption am Jejunum und am proximalen Ende des Ileums erfolgt. Die intestinalen Enterozyten sind polarisierte Zellen, und die Tight Junctions, die zwei benachbarte Zellen verbinden, bilden zwei unterschiedliche Membranstellen – die basolaterale und die apikale Membranstelle (Abbildung 2). Die Resorption von luminalen gelösten Stoffen, die durch den Aufschluss erzeugt werden, erfolgt an der apikalen Membranstelle⁴.

Der Histidintransport in den intestinalen Enterozyten an der apikalen Membran ist ein Beispiel für einen sekundären aktiven Symport, der natriumabhängig ist. Am basolateralen Ende bewegt sich das Histidin, das in den Enterozyten eintritt, über den Konzentrationsgradienten in den hepatischen Pfortaderkreislauf. Die intrazellulären Natriumkonzentrationen in den Enterozyten werden bei 12 mmole/L¹ gehalten, was niedriger ist als die extrazellulären/luminalen Konzentrationen, was auf das aktive Pumpen von Natrium aus der Zelle durch Na⁺ K⁺ATPase auf der basolateralen Membran zurückzuführen ist (Abbildung 3). An der apikalen Membran von Enterozyten sind das B⁰AT und der natriumneutrale Aminosäuretransporter (SNAT) 5 die Haupttransporter, die nicht nur Histidin, sondern auch Aminosäuren wie Asparagin und Glutamin in einem natriumabhängigen Cotransport transportieren ^5,6. Ein weiteres Transportprotein namens Large Amino Acid Transporter (LAT)1, das an der basolateralen Membran von Enterozyten vorhanden ist, transportiert große neutrale Aminosäuren wie Leucin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin über die Membran⁷.

Mit dem Ziel, das Konzept des Membrantransports in Kombination mit Techniken wie Spektrophotometrie und routinemäßigen biochemischen Assays durch erfahrungsorientierte Lernpädagogik zu lehren, ist es unerlässlich, Methoden zu entwickeln, die nicht nur das Konzept in leicht verständlichen Begriffen demonstrieren, sondern auch partizipatives Lernen für Studenten im Grundstudium ermöglichen. Derzeit stehen den Studierenden nur begrenzte Ressourcen für das praktische Engagement zum Erlernen solcher Konzepte der Biochemie zur Verfügung. Hier berichten wir über ein einfaches Protokoll zum Nachweis des Histidintransports durch die Darmmembran von Ziegen, das in Laboratorien leicht zu reproduzieren ist und auch für die Bewertung des Transports anderer Metaboliten angepasst werden kann. Noch wichtiger ist, dass bei der Methode kostengünstige Materialien in einem Labor für Studenten verwendet werden, wodurch erfahrungsorientiertes Lernen selbst in den einfachsten Laborumgebungen ermöglicht wird.