Summary

ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール

Published: October 04, 2024
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Summary

ここでは、ヤギの腸内でのヒスチジンの膜輸送を実証する安価で再現性の高い方法を報告します。このプロセスは、ナトリウム勾配によって可能になるヒスチジンイオンとナトリウムイオンを腸細胞膜全体に共輸送することによって発生します。この方法は、体験学習教育学を利用して、生体膜を横切る溶質の動きをよりよく理解します。

Abstract

ヒスチジンは必須アミノ酸であり、免疫系、肺換気、血管循環に関与する代謝産物の前駆体でもあります。食事性ヒスチジンの吸収は、腸細胞の頂端膜上に存在するブロード中性アミノ酸トランスポーター(B0AT)によるナトリウム共役中性アミノ酸輸送に大きく依存します。.ここでは、ヤギ空腸逆嚢を使用して、内腔からの腸絨毛腸細胞によるヒスチジンの吸収を示します。さまざまな濃度のナトリウムとヒスチジンに曝露された空腸嚢をアッセイして、時間の関数として嚢内のヒスチジンの濃度を決定しました。結果は活発なヒスチジン吸収を示しています。塩の濃度を上げると、ヒスチジンの吸収が高くなり、ヤギの腸管逆嚢におけるナトリウムとヒスチジンの吸収が共鳴していることが示唆されました。このプロトコールは、適切な修飾を施したアミノ酸または他の代謝産物の腸内移動性を視覚化するために適用することができます。この実験は、学部生が膜輸送の概念を理解するのに役立つ体験型教育ツールとして提案します。

Introduction

生体細胞は、細胞内サイトゾルを細胞外含有量から分離する膜脂質二重層に囲まれています。膜は、溶質1の動きを調節する半透性の障壁として機能します。生体膜を横切る輸送は、溶質の濃度や電荷など、いくつかの要因に依存する溶質の透過係数の影響を受けます。一般に、溶質は、受動的拡散、促進拡散、および能動的輸送2の3つのメカニズムを使用して膜内を移動します(図1)。単純拡散とは、可溶性、非電荷、および非極性の溶質が、半透膜を介して濃度勾配を下るプロセスです(図1A)。膜タンパク質は、高濃度の領域から低濃度の領域への溶質の移動を伴うため、このプロセスには役立ちません。拡散速度は、フィックの法則3に基づいています。一方、促進拡散はタンパク質依存性の輸送であり、メンブレンはエネルギーを消費することなく選択的な溶質のみが濃度勾配を通過することを可能にします(図1B)。この種の輸送は特異的であり、飽和速度論を示す点で単純な拡散とは異なります。

能動的輸送とは、ATPまたはイオン勾配を使用して、分子の濃度勾配に逆らって、つまり低濃度の領域から高濃度の領域への分子のタンパク質依存的な輸送です(図1C)。トランスポーターがATPを加水分解すると、その輸送は一次能動的輸送と呼ばれます(図1C、左パネル)。アクティブ・トランスポートの別の形式は、セカンダリ・アクティブ・トランスポートです(図1C、右パネル)。二次能動輸送では、溶質は電気化学的勾配に基づいて移動されます。これは、トランスポータータンパク質がイオン(通常はNa+)の濃度勾配への移動と、その濃度勾配に対する別の分子またはイオンの動きと結合するときに発生します。この種の溶質の動きは、溶質とイオンの両方が同じ方向に移動する共輸送(Symport)と、溶質とイオンが反対方向に移動する交換(Antiport)があります。

食物源からの食事性アミノ酸と単糖類は小腸で吸収されます。小腸は、機能的に十二指腸、空腸、回腸の3つのセグメントに分けることができます(図2)。溶質の吸収は小腸全体で起こり、最大の吸収は空腸と回腸の近位端で発生します。腸腸細胞は分極した細胞であり、隣接する2つの細胞をつなぐタイトジャンクションは、基底外側と頂端膜部位の2つの異なる膜部位を作り出します(図2)。消化によって生成された管腔溶質の吸収は、頂端膜部位4で起こります。

頂端膜における腸管内ヒスチジン輸送は、ナトリウム依存性の二次活性シンポートの一例です。基底外側端では、腸細胞に入るヒスチジンは、濃度勾配を下って肝臓門脈循環に移動します。腸細胞内のナトリウムの細胞内濃度は12 mmoles/L1に維持され、これは基底外側膜にあるNa+ K + ATPaseによって細胞外にナトリウムが活発に送り出されるため、細胞外/管腔濃度よりも低くなっています(図3)。腸細胞の頂端膜では、B0ATとナトリウム中性アミノ酸トランスポーター(SNAT)5が、ヒスチジンだけでなく、ナトリウム依存性共輸送5,6でアスパラギンやグルタミンなどのアミノ酸も輸送する主要なトランスポーターです。腸細胞の基底外側膜に存在するLarge Amino acid Transporter(LAT)1と呼ばれる別の輸送タンパク質は、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなどの大きな中性アミノ酸を膜を横切って輸送する7。

体験学習教育学を通じて、分光光度法や日常的な生化学的アッセイなどの技術と統合された膜輸送の概念を教えることを目的として、概念をわかりやすい言葉で示すだけでなく、学部生の参加型学習を可能にする方法論を開発することが不可欠です。現在、学生がこのような生化学の概念を学ぶための実践的な取り組みのために利用できるリソースは限られています。ここでは、学部の研究室で再現が容易で、他の代謝産物の輸送の評価にも適応できる、ヤギの腸膜を介したヒスチジン輸送を実証するための簡単なプロトコルを報告します。さらに重要なことに、この方法は学部の研究室で安価な材料を利用しているため、最も単純な実験室環境でも体験学習が可能です。

Protocol

図 4では、プロトコル全体とすべてのステップを概略図として示しています。この方法は、ラットの腸8を用いた先行研究から得られたものである。実験は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用されたサンプルは、商用ベンダーから調達されました。 注意:この実験中は手袋を着…

Representative Results

腸絨毛によるヒスチジンの逆嚢の内腔への吸収によるヒスチジンの腸内可動性を実証するための実験ワークフローを、 図4、 表1 および 表2に示す。3つの独立した実験セットアップを実行し、代表的なデータを 図6に示します。 与えられた実験条件下で、Paulyの反応を用いたヒ…

Discussion

膜輸送は、基礎または応用を問わず、すべての主要な生物科学分野の学部生に教えられる最も基本的な概念の1つです。従来、膜を横切る移動は、放射性同位元素で標識された代謝物を使用して視覚化されてきました。ただし、これらの方法は非常に危険であり、教育や学習には適していません。体験学習は、このような複雑な概念を理解するための最良の教育手法?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、デリー大学スリ・ヴェンカテーシュワラ・カレッジ生化学部の支援を受けています。著者は、研究室のスタッフの支援に感謝しています。

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes TARSONS 500020
10 mL Test Tubes BOROSIL 9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes TARSONS 546041
500 mL Beaker BOROSIL 10044977
500 mL Conical Flask BOROSIL 691467
D-Glucose SRL 42738
Digital Spectrophotometer SYSTRONICS 2710
Ethanol EMSURE 1009831000
Finpipettes THERMOFISHER 4642090
Glass Stirrer Rod BOROSIL 9850107
L-Histidine  SRL 17849
NaCl SRL 41721
Nitrile Gloves KIMTECH 112-4847
Petri Dish  TARSONS 460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) SRL 95131
Pipette Tips ABDOS P10102
Sodium Carbonate SRL 89382
Sodium Nitrate  SRL 44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) SRL 53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) SRL 22249
Sulphanilic Acid  SRL 15354

References

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Cite This Article
Haris, H., Kumar, P., Bhardwaj, V., Taritla, S., Malhotra, V., Narayanasamy, N. Demonstration of Membrane Transport of Histidine using Goat Intestinal Inverted Sacs: An Experiential Pedagogical Tool for Undergraduates. J. Vis. Exp. (212), e66882, doi:10.3791/66882 (2024).

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