感染したサルモネラ菌培養物からのバクテリオファージの除去

注:ファージの除去手順を実行する前に、9NAバクテリオファージに感染した サルモネラ 菌培養物の調製について説明します。 図1には、細菌培養物におけるバクテリオファージ除去の完全な手順の一般的な表現が示されています。 1. バクテリオファージに感染した サルモネラ 菌培養物の調製 細菌培養の準備注:この研究では、 サルモネラ菌 亜種 Enterica serovar Typhimurium株ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011)13 を使用しました。目的の S.enterica 株を含む-80°Cから回収したバイアルを氷上に置いてゆっくりと解凍します。 融解したジメチルスルホキシドストックから S.エンテリカ 株をレノックスブロス(LB)プレート(10 g / Lトリプトン、5 g / L NaCl、5 g / L酵母抽出物、および15 g / L寒天)にストリーク します。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。 接種針を用いて 、S.エンテリカ プレートからコロニーを移し、ガラス管内の5mLの液体LBに接種します。200 rpmで振とうして曝気しながら、37°Cで24時間インキュベートします。 バクテリオファージの調製注:このプロトコルでは、Siphoviridae科(Caudovirales目)14に属するバクテリオファージ9NAを使用しました。特に、リポ多糖のO抗原を受容体として使用する他の サルモネラ・エンテリカ ・バクテリオファージを使用することができる。100 mLの栄養ブロス(NB;5 g/Lペプトンおよび3 g/L酵母抽出物)、2 mLの50x E塩(38.78 mM MgSO47 H2O、520.5 mMクエン酸H2O、2.87 M K2HPO4 無水および829 mM NaNH4HPO44 H2O)および0.4 mLの50%の混合物に0.1 mLの濃縮バクテリオファージ溶解物を加えて、バクテリオファージブロスを調製します。グルコース。反転させてよく混ぜます。バクテリオファージ濃度の代表的な例は、109 PFU/mL(プラーク形成単位/mL)ですが、低濃度でも同様の結果が得られます( 材料の表を参照)。ステップ1.2.3に従ってバクテリオファージ濃度を推定します。 ライセートを調製するには、以下の手順に従ってください。5 mLのLB(10 g / Lトリプトン、5 g / L NaCl、および5 g / L酵母抽出物)で S.enterica 接種物を調製します。.37°C、200rpmで24時間インキュベートします。 4 mLのバクテリオファージブロスを1 mLの S.entericaの一晩培養液と混合します。混合物を37°C、200rpmで8時間インキュベートします。 細菌とバクテリオファージを区別するには、混合物を2,377 x g で20分間遠心分離します。ガラス管に上清を回収し、800μLのクロロホルム( 材料の表を参照)を加え、ボルテックスします。クロロホルムとの混合物を使用する場合にのみ、上相を移すようにしてください。注:手順の効率に影響を与える可能性のある残留クロロホルムの移行を防ぐことが重要です。クロロホルムステップは、放出されたファージを最大化する方法として、単離プロトコルと増殖プロトコルの両方で一般的です。しかし、クロロホルムは一部のファージを不活性化したり、その感染力を破壊したりすることがあります15。したがって、このステップはクロロホルムに耐性のあるファージにのみ適用できます。 ライセートを室温で2時間保持した後、4°Cで保存します。 ライセートを滴定して、調製したライセート中に存在するバクテリオファージの数/mLあたりのPFU数を定量します。これを行うには、以下で説明するオーバーレイ手法を実行します。S. enterica用の接種物5 mLのLBを調製します。200 rpmで振とうして曝気しながら、37°Cで24時間インキュベートします。 ライセートをLBに段階希釈して、可算数のPFU/mLに到達します。必要な希釈係数を決定するには、濃縮された最初のバクテリオファージライセートを特定します。約109 PFU/mLのバクテリオファージ濃度の代表的な例としては、プラークの数を数える希釈係数は106〜10 10です。 適切な希釈液100 μLと前日に調製した S. enterica の一晩培養液60 μLを、液体LBとLB寒天を1:1の割合で混合し、固化を避けるために56°Cに維持して調製したLB軟寒天5 mLに加えます。泡を避けて慎重に混ぜます。 各ミックスをLBプレートの上部に注ぎ、培地が固まるまでベンチに置いておきます。 プレートを37°Cで24時間インキュベートします。 各プレートのプラークの数を数えます。PFU/mL の数を決定するには、各プレートのプラーク数に希釈係数(FD)を掛けます。効率的なファージ感染を確保するには、109-10 12 PFU/mLが必要です。PFU/mL= いいえ。プレートのプラークxFD サルモネラ菌培養物のバクテリオファージによる感染S. entericaの一晩培養物を最終容量の5 mLのLBで1:100に希釈し、0.1 mLのライセート(10 9-1012 PFU / mLで濃縮)を加えます。37°C、200rpmで24時間インキュベートします。 プレートアッセイにおけるPFUとしてのファージ力価の測定感染した培養物中のバクテリオファージの数を定量するには、以下に説明するようにプレートアッセイを実施して、ファージ力価をPFU/mLとして決定します。培養物1mLをチューブに移します。17,115 x g で2分間遠心分離し、上清を新しい標識バイアルに注ぎます。 100 μLのクロロホルムをバイアルとボルテックスに加えて、溶液から細菌の破片を取り除きます。ステップ 1.2.3 に従います。 2.感染したサルモネラ菌培養物からのバクテリオファージの除去(図2を参照) 注:バクテリオファージの除去プロセスを監視するために、滴定のために洗浄プロトコル全体で異なるアリコートが採取されます。PFU/mL の数が洗浄プロセス全体を通じて減少し、完全に排除されるまで確認するための 8 つのアリコートがあります。 懸濁液中のバクテリオファージの除去ファージを含む細菌培養物を、50 mLのコニカル遠心チューブで0.22 μmろ過LBの5 mLで1:100に希釈します。滴定ポイント1:これは滴定(感染 したサルモネラ 菌培養の開始)の最初のアリコートです。 懸濁液を2,377 x gで10分間遠心分離します。上清を慎重に取り除きます。ピペットは使用しないでください。チューブを注ぎます。細胞の存在を確保するために、円錐形の遠心分離管の底にいくらかの体積を残すようにしてください。 0.22 μmろ過したLB培地10 mLで細菌細胞を洗浄します。遠心分離と洗浄のステップを3回繰り返します。ペレットを0.22 μmろ過LBの5 mLに再懸濁します。滴定ポイント2:これは滴定の2番目のアリコートです。 上記の細菌懸濁液50μLを、真空ろ過システムを使用して滅菌済みの0.45μmフィルター( 材料表を参照)に転写します。0.22 μmろ過LB100 mLでフィルターをすすぎます。注:バクテリオファージ9NAのヘッドサイズは0.067μmです。対照的に、 サルモネラ 菌は長さ2〜5μm、幅0.5〜1.5μmです。したがって、0.45μmのメンブレンを使用すると、ほとんどの細菌は0.45μmより大きいため通過しませんが、ほとんどのファージは0.45μmのフィルター孔を通過します。 サルモネラ菌の細胞内に含まれるバクテリオファージの除去細菌細胞からのファージ放出を促進するために、細胞を含む0.45 μmフィルターをインキュベーター内で37°Cで2時間インキュベートします。注:インキュベーションのこのステップは、感染した細菌の溶解とフィルターへの細胞内ファージの放出を促進するために必要です。 0.45 μmフィルターを真空ろ過システムを使用して洗浄し、0.22 μmフィルターLB100 mLでフィルターをすすぎます。 2 mLの2x LB(20 g/Lトリプトン、10 g/L NaCl、10 g/L酵母抽出物; 材料の表を参照)でフィルターから細菌細胞を回収します。これを行うには、滅菌鉗子を使用して0.45μmフィルターをフラスコに移します。次に、2 mLの2x LBをフィルターとピペットで数回加えて、フィルターから細胞を放出します。 この懸濁液1 mLを10,354 x gで2分間遠心分離します。上清を捨て、ろ過したLB培地1mLで細菌細胞を3回洗浄します。1 mLの2x LBに細胞を再懸濁します。滴定ポイント3:これは滴定用の3番目のアリコートです。注:以下で説明するように、市販のリポ多糖(LPS)が追加され、このLPSが水に溶解して培地が希釈されるため、より濃縮されたLB(2x LB)の使用を強くお勧めします。 以下に説明するように、市販のリポ多糖類で細菌細胞から放出されたバクテリオファージを欺くことにより、再感染を避けてください。.市販の S. enterica リポ多糖類(LPS; 材料表を参照)の存在下で、20 μLの細菌懸濁液をインキュベートし、最終濃度3.75 mg/mLまで、0.22 μmろ過LB1 mL中、200 rpmで振とうしながら37°Cで2時間インキュベートします。注:細胞から培地に放出されたファージは、細菌性LPSの代わりに市販の S.enterica LPSに結合する可能性があります。 2時間のインキュベーション後、1 mLの培養物をマイクロ遠心チューブに移し、懸濁液を10,354 x gで2分間遠心分離します 。 滴定ポイント4:上清を滴定の4番目のアリコートとして使用します。 ペレットを1 mLのろ過済みLB培地で3回洗浄します。 洗浄後、ペレットを1 mLの2x LBに再懸濁し、この混合物20 μLを0.22 μmろ過LB1 mLにインキュベートし、市販のLPS0.8 mg/mLを200 rpmで振とうしながら37°Cで2時間インキュベートします。滴定ポイント5:残りの細菌懸濁液を5回目の滴定に使用します。 2時間のインキュベーション後、1 mLの培養物を微量遠心チューブに移し、10,354 x gで2分間遠心分離してペレット化します。滴定ポイント6:上清を新しいバイアルに注ぐことにより、上清を滴定の6番目のアリコートとして使用します。 細菌細胞をろ過したLBで3回洗浄します。洗浄後、採取した細胞を0.22 μmろ過LB1 mLに再懸濁します。 真空ろ過システムを使用して、1 mLの細菌懸濁液を滅菌0.45 μmフィルターに通します。0.22 μmフィルターLB100 mLを使用してフィルターをすすぎます。 0.45 μmフィルターから2 mLの2x LB培地で細胞を回収します。そのためには、滅菌鉗子を使用して0.45μmフィルターをフラスコに移します。次に、2 mLの2x LBをフィルターとピペットで数回加えて、フィルターから細胞を放出してみます。 1 mLの細胞を10,354 x gで2分間遠心分離してペレット化します。0.22 μmフィルターLBで3回洗浄します。洗浄後、収集した細胞を1 mLの2x LBに再懸濁します。 滴定ポイント7:これは滴定用の7番目のアリコートです。このアリコートは、細菌培養におけるファージの除去の効率について通知します。 3. バクテリオファージ除去後のバクテリオファージフリー サルモネラ 菌培養液の調製 ファージフリー接種物を調製します。細菌懸濁液から100 μLの細胞を、0.45 mg/mL LPSを含む900 μLのLBに加えます。200 rpmで振とうしながら、37°Cで24時間インキュベートします。 滴定ポイント8:滴定用の8番目のアリコートを準備します(最終的な潜在的な非感染培養)。この点は、ファージの再感染がないことを確認するためのものです。